鼻咽癌组织差异mirna表达谱筛选和调控网络分析耳鼻喉头颈外科专业论文.docxVIP

博士学位论文构建miRNA调控网络的先例。关于miRNA在鼻咽癌中通过何种调控网络调节 博士学位论文 构建miRNA调控网络的先例。关于miRNA在鼻咽癌中通过何种调控网络调节 肿瘤的发生发展过程值得我们进行深入的探讨。 所以，本课题的目的在于筛选出鼻咽癌组织与正常组织间的差异miRNA表 达谱，利用生物信息学分析预测靶基因的功能分布，并构建以miRNA为中心的 调控网络，旨在从更加全面和深层的角度分析肿瘤的发病及发展机制，从而为进 一步改善鼻咽癌患者的治疗、预后奠定理论基础。 材料和方法 1． 临床资料 1．1 12例鼻咽癌组织和8例非癌鼻咽上皮组织用于LCM和高通量测序。所有 组织均经病理学检查确诊，鼻咽癌患者在活检前均未接受放化疗等治疗。鼻咽 癌组中病例的临床分期分布、年龄分布和性别比例与鼻咽癌临床特点相一致， 并按照相近的年龄分布与性别比例筛选对照组病例。 1．2 201例鼻咽癌组织和25例非癌鼻咽上皮组织用于高通量测序结果的qPCR 验证。病例的临床资料筛选标准同上，其中65例鼻咽癌组织和20例非癌鼻咽 上皮组织用于初步验证，检测miRNA与临床分期及TNM分期间的相关性通 过将样本量扩大至201例鼻咽癌组织和25例非癌鼻咽上皮组织。 2．组织标本的收集和冰冻切片的制作 组织标本在活检术后立即放入液氮中长期冻存。冰冻切片在．21℃．25℃之间 进行，选取组织最大横切面，调整切片厚度为8um，每个样品连续缓慢切片18． 20张后，在无水乙醇中固定10min。然后经过漂洗、苏木素染色、分化、伊红染 色、梯度酒精脱水、二甲苯透明等简易HE染色步骤制作LCM所需切片。 3．激光显微切割(LCM) 装置好玻片及配套样品收集离心管，在10倍或20倍镜下圈出目的区域，如 癌巢或者正常鼻咽上皮，于lO倍镜下进行切割，利用收集离心管管盖将切割后 的目的组织片进行粘附收集。切取完毕后在离心管内加入100ulRNAlater。然后 放于．80℃低温冰箱中保存。 lIl 万方数据 中文摘要4．组织总RNA抽提及质量监控 中文摘要 4．组织总RNA抽提及质量监控 按照Trizol和RNAiso Plus的protocol依次进行组织RNA的提取。分别利 用Agilent 2100生物分析仪和ND．1000微量核酸定量仪检测所得总RNA质量， 检测样品的总量、RIN值(RNA Integrity Number)、28S／18S以及OD260／OD280 数据，用于评判样品RNA质量。通过质量检测的RNA用于下一步测序建库及 荧光定量PCR检测。 5．文库构建与高通量测序。 根据华大TruSeq Small RNA样品准备流程，将通过磁珠分离的小RNA和 配体利用逆转录酶和随机引物逆转录成cDNA，并进行PCR扩增，所得文库经 Agilent 21 00生物分析仪检测后便可用于高通量测序。高通量测序使用lllumina Hiseq 2000测序平台，对肿瘤样品和对照非肿瘤样品采用边合成边测序(SBS． sequencing by synthesis)方式，将所得数据经过滤过、匹配和鉴定，再利用 Genespring软件筛选Fold change一2且具有统计学意义的差异miRNA。miRNA 表达量的单位为TPM(transcriptspermillion，公式为：单一miRNAreads数×10“6／ 总reads数) 6．荧光定量PCR反应 抽提鼻咽癌组织和非癌鼻咽上皮组织的总RNA，以稀释4．5倍的cDNA为 模板，U6 snRNA为内对照，采用SYBRgreen法进行PCR扩增，通过相对定量 2-ACp值代表miRNA的相对表达水平。 7．靶基因预测、GO分析、KEGG通路分析。 运用预测软件RNAhybrid、TargetScan、miRanda和PITA对差异miRNA进 行靶基因预测，对结果进行重叠与筛选。筛选出的靶基因用于Gene Ontology(GO， http：／／www．geneontology．org／)和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG， http：／／www．keggdp／kegg／rIathway．html)分析。 8．IPA工作流程 候选miRNA导入IPA在线数据库(http：／／www．ingenuity．corn)，软件会对差异 IV 万方数据 博士学位论文表达miRNA进行靶基因预测，并对他们之间的联系可信度进行评分，然后再利 博士学位论文 表达miRNA进行靶基因预测，并对他们之间的联系可信度进行评分，然后再利 用MicroRNA Target Filter功能选择与肿瘤相关的靶向作用关系，依据这些联系 构建miRNA的调控网络。 9．