单增李斯特菌弱毒株m7膜裂解因子的表达调控及其对细菌致病力的影响预防兽医学专业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘 要 单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，单增李斯特菌)是一种 重要的食源性病原菌，能引起李斯特菌病，表现为胃肠炎、败血症、髓膜炎、脑 炎等。该病在孕妇、老人及免疫力低下人群中多发，虽发病率不高，但死亡率高 达30％。单增李斯特菌为革兰氏阳性短杆菌，在自然环境中广泛存在；当其进入 宿主体内后，能迅速完成角色转换，成为胞内寄生菌。该菌在宿主体内的增殖、 扩散都在细胞质中完成，而建立感染的前提是菌体在膜裂解因子的作用下逃离吞 噬小体。本文旨在研究主要膜裂解因子李斯特菌溶血素(LLO，由hly编码)与 广谱磷脂酶C(PC．PLC，由plcB编码)在分离自消毒奶的弱毒株M7中的表达 调控状况，及其对M7菌株致病力的影响。 通过点突变技术构建了两株针对plcB 5UTR区域及ORF第l位的突变株， 发现其溶脂活性均消失，plcB基因在M7-plcB．ml和M7．plcB．砬中的转录水平 分别是亲本株M7的13．8％和27．6％，表明PC．PLC对菌株M7强溶脂活性具有 重要作用，且其编码基因5UTR区域也对该表型有影响。利用Tn917筛选出两 株溶脂活性消失的转座突变体，转座子插入位点分别在prfAORF内和P1启动子 中。这两株插入突变体的主要毒力基因(包括plcB、hly等)转录水平均低于亲 本株(P0．05或P0．01)，表明PrfA对主要毒力因子发挥重要调控作用。 利用同源重组技术构建my与plcB单缺失与双缺失突变株。乳酸脱氢酶 (LDH)试验表明，在相同MOI条件下，M7及plcB单缺失株对Caco．2细胞毒 性达86．8％和83．2％，hly单缺失株与hly-plcB基因双缺失株的细胞毒性仅为23．5％ 和11．1％。由此可见，LLO(hly)对Caeo．2细胞毒性作用具有决定性作用。但 双缺失株对小鼠毒力(LD50107’95)与亲本株(LD50=10TM)相似。表明LLO 介导细胞毒性且与致病性有关，但是其强溶血性和细胞毒性并非M7菌株弱毒的 机制。 通过对M7和强毒株EGD中PrfA氨基酸序列分析，发现3个差异位点，分 别为145、165与197位。据此构建两株以EGD prfA替换M7相应ORF的突变 株，其中一株仍保留亲本株PrfA第197位的氨基酸。这两株突变株的体外溶脂 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 活性均消失，溶血活性显著低于亲本株(P0．01)，表明了PrfA对PC-PLC和 LLO的调控作用。虽然两株突变株(M7．EGDprfA-1和M7．EGDprfA．2)的毒力 因子转录水平均显著低于M7(PO．01)而与EGD相仿(PO．05)，但其对小 鼠的毒力(LD50为105儿和104。64)仍低于EGD(LD50为101．99)。表明除PrfA、 LLO和PC．PLC外，M7菌株中可能还存在其它因子与其弱毒有关。 本研究为进一步探明膜裂解因子LLO和PC．PLC在弱毒株M7中的表达、 调控及其对细菌致病力的影响提供了许多有用的突变体，并做了大量前期工作： (1)M7菌株plcB的5-UTR区域影响其PC．PLC的表达，从而影响该菌株体外 强溶脂活性表型；(2)LLO在M7菌株对细胞的毒性中起重要作用：(3)PrfA 是单增李斯特菌的必需毒力因子，包括LLO与PC．PLC在内的多个毒力因子受 其调控，而在M7菌株中存在的PrfA差异氨基酸对其弱毒起重要作用。本研究 对后续深入研究具有重要意义。 关键词：单核细胞增多性李斯特菌；膜裂解因子；转录活化因子 2 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 Abstract Abstract As an important food-borne pathogen．Listeria monocytogenes may cause listeriosis menifested as gastroenteritis，septicaemia，meningitis and encephalitis． Listeriosis mainly affects pre