大鼠睾丸特异表达基因ube1的分离鉴定及生物学特征研究细胞生物学专业论文.docxVIP

北京协和医学院硕十研究生论文 北京协和医学院硕十研究生论文 声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：尜较 签字日期： 2p。g年 乡月 f日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解j竖塞逊塑医堂医有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权j垦塞迹塑匡堂暄可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 书瓢 导师签名： 镶壶每 签字日期： 加口g年 g月1 日 签字日期：埘年6月1 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：中科院生物物理研究所 通讯地址：北京市朝阳区大屯路15号 邮编：100101 北京协和医学院硕士研究生论文 北京协和医学院硕士研究生论文 中文摘要 中文摘要 精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程，是相关基因严格受时空 调控相继转录表达的结果。生精细胞的发生分多阶段进行，曲细精管截面上不仅可以 看到处于精子发生过程不同阶段的各种生精细胞的组合，还可以看到支持细胞、间质 细胞等其它类型的细胞。它们分别具有自己的基因时空表达规律，但是此过程中的分 子机制尚未完全阐明。因此分离得到单一的生精细胞群并建立单一细胞类型的cDNA 文库，就可以特异性地研究单一细胞的基因表达和有效地筛选不同生精细胞群之间差 异表达的基因。本研究采用牛血清白蛋白的梯度沉降法分离高纯度生精细胞，并通过 抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization,SSH)技术，构建了A型精原 细胞和粗线期精母细胞的双向消减eDNA文库，并对筛选出来的部分已知和未知基因 进行深入探索。 根据SSH的结果，我们从A型精原细胞和粗线期精母细胞的双向消减cDNA消 减文库中选择了576个PCR纯化产物进行斑点杂交(Dot Blotting)分析，以验证差异 表达并分析其表达差异的强度。结果得到480个克隆在两种细胞之间表达差异相差大 于2倍。随后我们选取40个存在明显表达差异的克隆进行测序分析，共产生了37个 质量满意的ESTs序列，总测序成功率达到92．50％。 将这些EST分为已知基因、已知EST和全新EST三类。由于不同组织中基因的 表达水平不同及eDNA文库构建所产生的冗余性，结果从大鼠A型精原细胞和粗线期 精母细胞双向消减eDNA文库中得到的已知基因、已知EST和全新EST分别为89．19％、 5．40％和5．40％。对代表已知基因的ESTs按照功能分类，发现主要涉及细胞凋亡、信 号传导和细胞间物质运输、细胞结构／运动、转录调节、代谢、线粒体基因几类，并初 步探讨了大鼠精子发生过程中差异表达基因的作用和意义。 将大鼠精原细胞特异表达的克隆编号为P5810的EST序列进行RACE(Rapid Amplification ofcDNA Ends)技术扩增，获得一个新的eDNA序列，命名为大鼠泛素激活 酶基因(RattusnorvegiCUS Ubiquitin-Activating Enzyme E1，Ubel)。在我们发现大鼠UbeI 之前，GenBank库中没有大鼠Ubel的报道，我们第一次克隆了大鼠的Ubel基因的全长， 北京协和医学院硕上研究生论文 北京协和医学院硕上研究生论文 中文摘要 登录GenBank，获得登录号为EF690356。该基因序列全长3433bp，其中开放阅读框有 3171bp，编码一个含1057个氨基酸的蛋白质。预测其编码蛋白分子量为11．78kD，等电 点5．32。Blast比对显示，UbeJ基因与小鼠泛素激活酶基因(陬JyZ)的同源性为92％， 与人泛素激活酶基因(咖)的同源性为83％。Ubel基因编码的蛋白质包含了泛素激 活酶信号位点和泛素激活酶活化位点，分别位于410-418缸和629．637aa，它们均存在于 人类和小鼠的泛素激活酶中。 逆转录一聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR) 结果显示，Ubel在大鼠睾丸中大量表达，而在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、卵巢 中没有表达；我们用RT-PCR和荧光定量PCR检测了精原细胞、粗线期精母细胞、圆形 精子细胞和支持细胞中叻e珀勺表达特性