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实验一 显微镜（油镜）的使用和细菌 的三种基本形态观察 一、实验目的 1、学习并掌握油镜的基本原理和使用方法。 2、观察和识别细菌的三种基本形态。 二、基本原理 2 、增加显微镜的分辨率 分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离的能力。D值愈小则表明分辨力愈强。 D=0.61λ/NA NA=n·sinα/2 λ：光波波长 NA：物镜的数值孔径值 n：介质折射率 　　　　　α：镜口角（总是小于180°） 三、实验器材 1 、标本：细菌三型玻片。 2 、试剂：香柏油、镜头清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）。 3 、器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸、玻璃棒等。 四、实验步骤 1 、放置标本:将染色的细菌三型玻片置于镜台上。 2 、找合适的视野: 先用低倍镜和高倍镜寻找合适的视野并将欲观察的部位其移到视野中央。 3 、加香柏油。 4 、转换油镜：将油镜转到工作位置，使油镜镜头浸入香柏油中。注意油镜镜头千万不要压在玻片标本上。 5 、调节聚光器与油镜数值孔径一致 ： 将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大。 6 、调焦： 转动细调焦螺旋，再缓慢地提升油镜调焦至物像清晰。注意下降或上升镜筒或载物台绝不可用力过猛。 7 、观察: 仔细观察细菌的三种基本形态 8 、显微镜用毕后的处理: 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜 注意事项 1 、油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切忌用眼 睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从侧面注视。 2 、调焦时，应特别注意，切勿将粗调节器向反方向(由高向低)转动而损失镜头和玻片。 实验报告 1、绘细菌三种基本形态图 2、简述油镜的工作原理 实验二 细菌的芽孢染色和 革兰氏染色法 1 、革兰氏染色原理 革兰氏染色法是Gram发明的一种细菌鉴别染色法，通过这种染色方法，可将细菌分为两大类： 一类被染成紫色，称为革兰氏阳性细菌； 一类被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。 其染色原理主要根据两类细菌的细胞壁化学组成和结构不同。 二、基本原理 通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物，G+细菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，因此遇脱色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。 反之， G-细菌的细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄，交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此细胞褪成无色。再经番红、沙黄等红色染料复染, 就使G-细菌呈现红色, 而G+细菌则保留紫色。 2 、芽孢染色原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。 三、实验器材 1 、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。 2 、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、 95%乙醇、番红复染液； 芽孢染液:5%孔雀绿染色液、 0.5%番红水溶液。 3 、器具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、 木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸等。 四、实验步骤 1 、革兰氏染色 2、芽孢染色 染色结果（革兰氏染色） 染色结果（革兰氏染色） 染色结果（芽孢染色） 注意事项 1、革兰氏染色关键是脱色时间，如脱色时间过长，会造成假阴性。如脱色时间过短，会造成假阳性。 2、革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 3、芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在菌体内为宜。芽孢杆菌一般在37℃下培养12-14h效果最佳。 4、在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。 实验报告