ompx过表达对肠外致病性大肠杆菌δtolc株生物被膜形成特性的影响预防兽医学专业论文.docxVIP

OmpX过表达对肠外致病性大肠杆菌AtolC株生物被膜形成特性的影响目 OmpX过表达对肠外致病性大肠杆菌AtolC株生物被膜形成特性的影响 目 录 摘 要 ．i Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．iii 缩略词(ABBREV认TION) ．．v l文献综述 ．．1 1．1肠外致病性大肠杆菌概述 ．．1 1．1．1大肠杆菌的简介和分类 1 1．1．2肠外致病性大肠杆菌概述 2 1．1．3肠外致病性大肠杆菌的流行病学分析 2 1．1．4肠外致病性大肠杆菌的主要致病机制 2 1．1．5肠外致病性大肠杆菌的诊断和防治 3 1．2．生物被膜概述 ．．4 1．2．1．生物被膜概述及危害 4 1．2．2．生物被膜的形成过程及主要的参与因子 4 1．2．3生物被膜形成的调节机制 7 1．2．4大肠杆菌生物被膜的控制和清除 8 1．3．大肠杆菌外膜蛋白概述 一8 1．3．1．外膜蛋白简介、结构、分类及功能 8 1．3．2．外膜蛋白TolC概述 一9 1．3．3外膜蛋白OmpX概述 ．10 2．研究目的和意义 12 3．材料与方法 13 3．1材料 ．13 3．1．1菌株和质粒 ．．13 3．1．2主要试剂、试剂盒与仪器 ．14 3．1．3主要培养基、抗生素及相关溶液的配置 ．．15 3．2方法 1 6 3．2．1引物设计与合成 ．．16 3．2．2猪源ExPEC的复苏增殖和基因组DNA提取 ．．17 3．2．3质粒的小量制备 ．17 3．2．4电转感受态细胞的制备 ．．1 7 3．2．5 WZ．ompX和Z3tolC：：ompX菌株的构建 17 3．2．6试验菌株生长特性的测定 ．18 3．2．7试验菌株对抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)的测定 ．．18 3．2．8细胞黏附侵袭能力测定 ．19 万方数据 华中农业农业大学2016届硕士研究生学位论文3．2．9巨噬细胞内存活能力测定 华中农业农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．2．9巨噬细胞内存活能力测定 19 3．2．10生物被膜形成能力测定 19 3．2．11 Curli合成能力的评价 20 3．2．12高渗应激环境对生物被膜的形成能力的影响 20 3．2．13 Curli菌毛转录水平验证 20 3．2．14 qRT-PCR验证高渗条件OmpX的表达量 21 3．2．15转录组分析差异基因 22 3．2．16数据分析 22 4．结果与分析 ．23 4．1 PPECC42全基因组测序 23 4．2过表达菌株的构建并验证表达 23 4．3生长特性评价测定 24 4．3．1遗传稳定性评价 24 4．3．2生长曲线测定 25 4．4最小抑菌浓度(MIC)测定 ．25 4．5细胞黏附侵袭能力分析 ．26 4．6巨噬细胞内存活能力分析 26 4．7生物被膜形成能力分析 27 4．7．1生物被膜形成能力分析 27 4．7．2高渗应激对生物被膜形成的影响 28 4．7．3 Curli合成能力评价 ．．28 4．7．4 qRT-PCR验证Curli合成相关基因csgD和csgB的转录表达 ．．29 4．8 qRT-PCR检测高渗条件下OmpX的表达量 30 4．9转录组分析差异基因 ．30 4．9．1差异基因表达分析 30 4．9．2靶标差异基因的筛选 3 1 5讨{念 34 5．1 OmpX与TolC相互作用调节细菌抗渗透应激和生物被膜的形成 ．．34 5．2转录组学测序寻找在生物被膜和抗渗透方面的差异基因 34 5．3差异基因cpxP和bhsA在生物被膜和抗渗透方面的功能 35 6结论 37 参考文献 38 附录 49 致谢 50 万方数据 OmpX过表达对肠外致病性大肠杆菌atolC株生物被膜形成特性的影响摘要 OmpX过表达对肠外致病性大肠杆菌atolC株生物被膜形成特性的影响 摘要 肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli，ExPEC)作为 一种重要的人兽共患病病原和食源性致病菌而备受关注。它可通过污染食物、水源 和饲料等造成传播，引起人和动物的肠外组织感染。而生物被膜形成增强了其多重 耐药性和体内外抗逆特性，更增加其防控难度。因此，必须加强对细菌生物被膜形 成机制及影响因子的研究，以便制定有效的防控策略。 外膜蛋白TolC作为革兰氏阴性菌多种外排泵系统的主要组成部分，不仅介导进 入细胞内的分子外排和自身代谢分子、毒素分子的外排，而且在维持外膜完整性和 生物被膜形成过程中也具有重要的