上西早生柿etr5基因片段的克隆与植物表达载体的构建农产品加工及贮藏工程专业论文.docxVIP

摘要 摘要 柿粟属于跃交型果实，采收后极易软化，给柿果的贮藏运输带来不便。大量研究 证实，乙烯是跃变型成熟果实的催熟剂。跃变型果实中自我催化的乙烯合成反应启始 后，合成大量乙烯。利用转基因技术抑制或降低果实乙烯的生物合成，可以降低果实 乙烯的含量。磊乙烯只麓与受体结合屠么‘能窟动一系列的信号转导过程，完成果实完 熟过程。本研究以柿叶片为材料，克隆分离了ETR5基因，成功构建了于扰表达载体， 结果如下： 1．利用Rneasy@Plant Mini Kit试剂盒成功提取了嵩质量的RNA，RNA的OD2∥OD2so 比值为2．0896，为mRNA的反转录奠定了基础。 2．mRNA的反转录采用了QIAGEN公司的反转录试剂盒(Om摭isefip，M RT Kit)，分离 到完整性好的mRNA，为继后的RT-PCR提供可靠保证。 3。根据巴发表的植物ETR保守氨基酸序列，设计了一对特异性引物，进行RT-PCR扩 增，得到一个长549bp的片段，经序列分析证明该片段具有的保守区氨基酸序列。 4．通过分析已获褥ETR5基因片段，用PCR法去除内含子，并将得到的片段转化到大 肠杆菌中经过鉴定及测序，证明去除内含子的基因片段。 5．设计两对特异性引物分别含有酶切位点Xba I和Sac I、Sma I和Sac I，用PCR 法将酶切位点克隆到ETR5基因序列上。 6．得到两条长度不同且分别含有Xba I和Sac I、Sma I和Sac I酶切位点的扩增产物 后，．以限制梭内切酶Sac{分别消化后，用T4 DNA连接酶将酶切大片段连接，并转 化到大肠杆菌DH5a中。 7。用Xba l和Sma 1分别酶切合有ETR5基因的质粒和pSMAK311质粒，将ETR5基 因插入到含有CaMV 35S启动子的pSMAK3 1 1质粒中，构建成RNAi植物表达载体 pSMAK-ETR5一RNAi。 8．利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHAl01中，经特异性引物对转化茵液进行 PCR扩增，证实表达载体己转入农杆菌中。 关键词：柿果；ETR5；基因克隆；酶切；植物表达载体 Uenishiwase Uenishiwase Persimmon ETR5 gene cloning and its plant expression vector construction Author：Chen Jia Major：Primary product processing and storage engineering Supervisor：Ma Junlian Professor Zhang Zide Professor Abstract Persimmon fruit，a climacteric fruit，is very defficult to be storaged and transported because it iS easy ti be soften after harvested。A large body of evidence has demonstrated that ethylene iS the hormone of catalyzing fruit ripening．After the start of rthylene biosymthsis in fruit，enthylene production incresae fast．Make use of transgenic technique to inhibit or decrease the ethylene biosynthsis of climacteric fruit．can descrease the content of ethylene in fruit。And the ethyrlene must combined with the ethlene responses to work．In the present study，we have cloned the ETR5 gene frament using total RNA extracted from the persimmon fruit，identified by sequencing and further constructed in the plant expression vector．The results were as fellow： 1．The quality RNA was extracted by Rneasy圆Plant Mini Kit．The value of OD260／