电子转运黄素蛋白β减轻糖尿病肾病肾小管上皮细胞凋亡的作用及机制研究药理学专业论文.docxVIP

博士学位论文电子转运黄素蛋白p减轻糖尿病肾病肾小管 博士学位论文 电子转运黄素蛋白p减轻糖尿病肾病肾小管 上皮细胞凋亡的作用及机制研究 所院：中日友好医院临床医学研究所 姓名 ：王华 指导教师：李平教授 学科专业：药理学 研究方向：糖尿病肾病发病机制研究 完成日期：二零一五年五月 万方数据 目录中文摘要 目录 中文摘要 l Absl】‘act ． ． ． ． ． ． ． ． ． ．4 缩略词表 8 前 言 10 第一部分ETF[3表达与糖尿病肾病进展的相关性研究 ．．13 实验一ETFfl在两种不同糖尿病肾病大鼠模型中的表达 1 3 一、材料和方法 14 二、结果 23 三、讨论 27 实验二ETFfl在自发性糖尿病肾病模型中的表达 30 一、材料和方法 31 二、结果 ．32 三、讨论 35 小结 ．38 第二部分糖尿病肾损伤大鼠肾小管凋亡机制研究 39 一、材料和方法 40 二、结果 41 三、讨论 ．43 ／J、结 ．46 第三部分ETFIB减轻脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡及其机制研究 ．．47 实验一ETFl3敲降对脂肪酸诱导的NRK 52E细胞凋亡的影响 ．48 一、材料和方法 48 二、结果 52 三、讨论 56 实验二ETFl3过表达对脂肪酸诱导的NRK 52E细胞凋亡的影响 ．59 一、材料和方法 59 二、结果 66 三、讨论 70 小结 ．72 第四部分总结 ．．73 参考文献 75 综j苤 ．85 致谢 ．．104 万方数据 摘要中文摘要 摘要 中文摘要 背景： 糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之一，一旦出现大量蛋白尿，肾功能 将不可逆性进行性下降，最终发展为终末期肾病。由于其发病机制复杂，目前尚无 理想的治疗方案。过去研究的重点聚焦在高血糖对糖尿病及其并发症的危害上，近 些年人们认为脂肪酸代谢障碍是糖尿病及其并发症的原发病理生理改变。其中血游 离脂肪酸升高在非脂肪组织蓄积造成的损伤，即脂毒性，既是糖尿病患者发病的可 能病因之一，也是促进疾病进展和加重的关键因素。在糖尿病肾病中，脂毒性己被 证实是进展性。肾小管损伤的重要病理机制之一，并和肾脏疾病预后密切相关。电子 转运黄素蛋白(electron transfer flavoprotein，ETF)是脂肪酸D氧化中12种线粒体 脱氢酶的电子接受体，由Q和B亚单位组成，存在于生物体细胞线粒体内。本实验 室前期通过糖尿病肾病大鼠肾皮质蛋白组学研究发现ETFl3在保守序列位点出现点 突变，提示其可能在糖尿病肾病发生发展中发挥重要作用。 目的： 本研究通过建立不同糖尿病肾病大鼠模型以观察ET耶的表达和分布，及与糖 尿病肾损伤之间的关系和机制；通过过表达和敲降技术，探讨ETFl3在棕榈酸 (plamitate，PA)诱导的肾小管上皮细胞凋亡中所起的作用。综合体内外实验评价 ETFB在糖尿病。肾病中的作用，为进一步深入认识糖尿病肾病发病机制提供新思路， 同时为疾病治疗提供新的药物候选靶点。 方法； 体内实验分为两部分，首先分别通过链脲佐菌素腹腔注射合并高脂饲料喂养制 备轻度肾损伤模型，及链脲佐菌素注射合并单侧肾切除诱导重度糖尿病肾损伤大鼠 模型，探讨ETFIB在链脲佐菌素诱导的两种糖尿病肾病模型大鼠肾皮质中表达的变 化。此外，通过2型自发性糖尿病OLETF大鼠模型，观察肾病进展的两个阶段， 分别为36周龄的轻度肾损伤和56周龄的重度肾损伤。用Western blot和免疫组化 方法检测ETFI]在正常及模型组大鼠肾皮质的分布和表达情况；固定肾组织通过 PAS染色观察肾脏病理损伤，然后分析ET邛的表达变化与糖尿病。肾病发生发展之 间的关系。此外，在OLETF大鼠模型中，分析肾损伤的机制：用TUNEL法检测 两个时间点的细胞凋亡情况，然后通过Westernblot检测线粒体凋亡通路蛋白变化， 包括胞浆细胞色素C、BAX、Bcl一2及Cleaved caspase．3的表达变化，此外检测肾 组织NOX4的表达。 体外实验部分，探讨ETF[B对脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机 制。首先通过敲降实验观察了ET耶在低表达时对脂肪酸诱导的细胞凋亡的影响： 万方数据 摘要 摘要 设计并筛选出敲降效率高的ETFl3基因siRNA Oligo干扰序列，转染至大鼠近端肾 小管上皮细胞NRK 52E，24h后在培养基中加入终浓度为0．5 mM PA，再过24 h 后检测ROS生成，BAX、Bcl．2和Cleaved caspase一3蛋白表达，通过流式检测线粒 体膜电位和细胞凋亡率，TUNEL法检测细胞凋亡情况，比较脂肪酸诱导的细胞凋 亡通路改变与敲降ETFI：；合并脂肪酸刺激的差异，分析ETFl3低表达对脂毒性凋亡 的影响。另一方面，通过构建ETFf3过