钙调蛋白结合蛋白及其磷酸化对乳腺癌细胞运动能力的调节作用生物医学工程专业论文.docxVIP

钙调蛋白结合蛋白及其磷酸化对乳腺癌细胞 钙调蛋白结合蛋白及其磷酸化对乳腺癌细胞 运动能力的调节作用 ⑧ 重庆大学博士学位论文 学生姓名：江奇峰 指导教师：蔡绍皙教授 副导师：C．L．Albert Wang教授 专 业：生物医学工程 学科门类：工学 。；llll％¨女* 矿。 重庆大学生物工程学院 二O—O年四月 -、Vaa--.4 ， Effect Effect of C aldesmon and Its ion on Breast Cancer Cell Mobility ⑧ A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Doctor of Engineering Bv Jiang Qi Feng Supervised by Prof．C ai Shaoxi Ass．Supervised by Prof．C．L．Albert Wang Maj or：Biomedical Engineering College of Bioengineering of Chongqing University， Chongqing，China April，2010 中文摘要摘 中文摘要 摘 要 乳腺癌是全球女性癌变诊断率最高的癌症之一，由于其高转移活性以及转移 后高达90％的死亡率而备受人们关注。无序生长和高运动活性是转移性乳腺癌细 胞的重要特征，这两个过程都涉及到细胞肌动蛋白骨架在各种肌动蛋白结合蛋白 调节下的解聚与重排。钙调蛋白结合蛋(Caldesmon，CaD)是存在于几乎所有脊 椎动物细胞中的肌动蛋白结合蛋白，有由同一基因衍生的两种亚型：平滑肌型(h— caldesmon，h-CaD)和普遍存在的非肌型轻链CaD(1．caldesmon，1-CaD)。 体外研究表明，1-CaD通过与肌动蛋白结合，稳定肌动蛋白纤维结构，抑制 其解聚。因此，人们都普遍认为1-CaD在细胞内的基本功能为减弱细胞骨架调 整，抑制细胞运动活性。事实上，在众多非转移性癌细胞中，1-CaD的表达量显 著下调，但在一些高迁移活性的转移性癌细胞中，1-CaD不仅表达量明显增加， 胞内磷酸化程度也大幅度提高，抑制细胞运动活性显然不能完全概括1．CaD在转 移性癌细胞中的功能。为揭示l—CaD对转移性乳腺癌细胞迁移运动活性的影响及 其调节机制，并为进一步认识乳腺癌本质提供了新的思路，本研究以人源转移性 乳腺癌细胞MD MB．231和非转移性乳腺癌细胞MCF一7作为实验载体，首先，通过 构建体外肌动蛋白聚合阵列验证了l-CaD及其磷酸化对肌动蛋白聚合过程的影 响；其次，通过基因沉默和外源基因高表达相结合的方法，探索1．CaD及其磷酸 化对转移性乳腺癌细胞迁移运动活性的可能调节机制；最后，我们将模拟l—CaD 磷酸化位点封闭的合成多肽导入MD MB．231细胞内并通过裸鼠肿瘤形成模型，进 一步检测1．CaD及其磷酸化对转移性乳腺癌细胞迁移运动活性以及在体肿瘤形成 能力的影响。我们的主要研究内容包括： ①体外蛋白层次上，利用荧光标记的G—actin，在F．actin缓冲体系中，不同时 间位点分别加入1．CaD的c．端功能片段H32K及其磷酸化形式，检测G．actin聚合形 成F．actin的动力学过程。结果显示，H32K能够迅速与肌动蛋白结合，并对肌动蛋 白的聚合过程有双重调节作用：在肌动蛋白聚合初期，H32K将抑制成熟肌动蛋 白纤维的形成；在肌动蛋白聚合过程中，H32K将促进成熟肌动蛋白纤维的形 成。磷酸化H32K失去了对肌动蛋白聚合初期的抑制作用，对肌动蛋白聚合无显 著影响。 ②细胞层次上，western-blotting检测MDA MB．231、MCF一7以及正常人源上 皮细胞HMEC的胞内1-CaD表达量及其磷酸化程度。结果显示，l-CaD在MDA MB一231细胞中获得了显著高表达，其表达水平与HMEC细胞相当，而MCF一7的1． CaD表达量显著低于MDA MB．231细胞。除此之外，MDA MB．231胞内1．CaD磷 重庆大学博士学位论文酸化水平显著高于HMEC细胞。l-CaD在转移性乳腺癌细胞中的高表达以及显著 重庆大学博士学位论文 酸化水平显著高于HMEC细胞。l-CaD在转移性乳腺癌细胞中的高表达以及显著 高于正常细胞的磷酸化水平，可能是转移性乳腺癌细胞高侵袭表象的一个重要因 素。 ③利用siRNA慢病毒载体感染MDA MB．231细胞，抑制胞内l-CaD表达，首 先，通过western．blotting，检测1-CaD基因沉默的效率；其次，通过rhodamine phalloidin染色细胞