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中文摘要中文摘要 中文摘要 中文摘要 TREKl通道阻滞剂筛选及其抗抑郁机制的探讨 东南大学医学院 博士研究生：叶冬青 导师：张志瑶 研究背景与目的： 当前的抗抑郁药低有效率低己成为抑郁症治疗最突出的临床难题之 一。近年来基因工程鼠研究表明TREKl亚型双孔钾离子通道(TWIK．related mechano— gated two pore K+channel)是抗抑郁治疗的靶点，阻断该通道与提高抗抑郁剂疗效相关。 而药物基因组学研究也表明TREKl基因多态性与抗抑郁剂耐药有关。然而目前尚缺乏 理想的TREKl通道阻断剂，阻断TREKl通道发挥抗抑郁效应的机制也知之甚少。因此 本课题拟筛选高效TREKl阻滞剂，评估其抗抑郁疗效，并进一步探讨阻断TREKl通道 发挥抗抑郁样作用的机制。 方法： 1．通过分子克隆技术构建TREKl钾通道重组质粒TREKI—pCDNA3．1(+)／ pEGFP-N1，并将质粒转染人胚。肾293细胞(Human embryonic kidney，HEK293)，实现 TREKI通道蛋白体外表达。2．利用铊离子荧光高通量筛选法筛查中国科学院上海药物 所国家化合物库，筛选可能阻断TREKl通道的化合物；利用全细胞膜片钳技术检验筛 选化合物对TREKl钾通道的敏感性、特异性。3．利用表面等离子体共振(Surface plasmon resonance，SPR)技术测定筛选化合物与TREKl和五羟色胺1A受体(5-hydroxytryptamine receptor 1A，5-HTRlA)亲和力。4．通过药代动力学实验确定筛选化合物干预动物模型的 有效剂量。5．通过慢性不可预知温和应激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)结合 孤养法建立抑郁症动物模型，给予筛选的TREKl阻断剂、文献报道的TREKl阻断剂 spadin和抗抑郁剂西酞普兰进行二fi预，利用强迫游泳实验(Forced swimming test，FST)、 开场实验(Open field test，OFT)及蔗糖水偏好实验(Sucrose preference test，SPT)评估筛选 化合物的抗抑郁疗效。6．通过场电位电生理实验测量阻断TREKl后抑郁模型大鼠中缝 核(Dorsal raphie nuclei，DRY)5一HT能神经元、前额叶(Prefrontal cortex，PFC)锥体神经 元场电位的变化。7．利用免疫印迹及real—time PCR方法检测阻断TREKl通道后2周及 4周抑郁模型大鼠DRN、PFC及海马CAl／CA3区蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)、 环磷酸腺苷反应原件结合蛋I兰t(cAMP．response element binding protein，CREB)和脑源性 神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)表达变化。8．利用全细胞膜片钳 技术检测5-HTRIA激动剂和拮抗剂对表达在HEK293细胞膜上TREKl通道钾电流的影 万方数据 万方数据 万方数据 东南大学博士学位论文 东南大学博士学位论文 响；在原代培养的孕17天胎鼠海马神经元中分别应用筛选的TREKl阻断剂和文献报道 的TREKl阻断剂spadin，并同时给予5-HTRlA激动剂和拮抗剂干预24h，通过免疫印迹 法观察5-HTRlA功能对神经元PKA、CREB和BDNF信号分子表达的影响。 结果： 1．高通量筛选的化合物SIDl900抑制TREKl通道荧光强度的Ic50值为28．72土 3．67pM，该化合物在0mV下阻断TREKl通道钾电流的IC50值为29．72士2．49M，且对原 代培养的海马神经元双孔钾离子通道(Two pore K+channel，K2P1具有特异性阻断作用 ∞o．001，IC50=87．09士4．2“M)，对Na+、ca2+和混合K+离子通道无显著N D帅0．05)。2． SPR动力学数据显示：不同浓度S1D1900与TREKl钾离子通道均具有较高亲和力，平 衡解离常数(KD)为1．905×10-10 M。3．药代动力学数据表明：SIDl900可通透大鼠血脑 屏障(通透率78．74％)且生物利用度良好(78．03士9．65％)，有效干预剂量为14．33 gM／kg。 4．与CUMS应激抑郁模型组相比，SIDl900干预2周可显著减少大鼠FST不动时间 ∞0．001)．疗效早于西酞普兰一周；另外在改善大鼠OFT水平活动、垂直活动评分及恢 复蔗糖水偏好性方面，SIDl900也显著优于西酞普兰⑦=0．001，p0．001，p=0．031)，与 spadin一致