人类生精新基因tsarg4及小鼠同源基因srg4的分子克隆及其功能的初步分析遗传学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 生精障碍是导致男性不育的一个主要因素，当前的研究认为，约 10～15％的特发性无精症和少精症是由于位于Y染色体上的AZF基因 发生微缺失引起的，其中以AZFc缺失为主。本室傅俊江等对中国人 群的研究也证实了这一点。然而仍有85～90％的男性不育是由于其他 生精基因发生了变化引起的。为了探索其中的分子机制，近年来人们 已克隆了人类的Odfl、Odja、Sak57、SPAG4、SPAG5、ZNF313等基 因，但是仍有许多新基因尚未克隆。 本研究试图从已知功能的人及大鼠SPAG4(sperm antigen 4)基 因出发，充分利用国际人类基因组计划的研究成果，采用信息分析和 实验手段相结合的办法，快速克隆人类生精基因TSARG4及小鼠同源 基因SRG4，并进行初步功能研究，为了解人类精子发生的分子机制奠 定基础。本研究分为四部分，其主要研究方法及实验结果如下： 第一章TSARG4基因的克隆与序列分析 从已知功能的人类精子尾部基因SPAG4(sperm antigen 4)出发， 在人类dbEST数据库中同源搜寻与人类SPAG4基因编码氨基酸有较 高同源性的表达序列标记，找到一个在人类睾丸中表达的EST A／700454，该EST编码的氨基酸与人类SPAG4基因编码氨基酸3’端 有55％的同源性。通过信息分析，发现该EST与小鼠假想基因 AK006225的3’端高度同源，经过信息分析找到了与A／700454邻近的 另外一个ESTBG720564。在这两个ESTs上分别设计引物X1、X2， 以睾丸文库eDNA为模板进行PCR扩增，填平这两个ESTs之间的 间隙，从而快速克隆了人类生精基因TSARG4(testis and spermato． genesis related gene 4，TSARG4)(GenBank登录号为AF401350)。应用 RT-PCR对TSARG4基因序列进行扩增、测序验证。我们将这种快速 延伸EST的新方法命名为“问隙填充法”。该方法可以作为3-或 5-RACE的替代方法，有望广泛应用于基因克隆。 信息分析表明，TSARG4基因编码379个氨基酸，定位于20q11．2， 推定编码379个氨基酸，预计分子量为43 081．45，等电点为8．61。 预测TSARG4是一个跨膜蛋白，有N．糖基化位点2个，蛋白激酶C 预测TSARG4是一个跨膜蛋白，有N．糖基化位点2个，蛋白激酶C 磷酸化位点6个，酪蛋白激酶II磷酸化位点2个，N一肉豆蔻化位点 3个。TSARG4与SPA(74基因编码氨基酸的同源性为45％。 第二章TSARG4基因的初步功能研究 (一)TSARG4基因表达谱分析 RT-PCR和Northernblot结果表明，成人中TSARG4基因只在睾丸 中高表达，而在所检测的其他组织如：脾、胸腺、前列腺、卵巢、小 肠、大肠(无粘膜)、外周血白细胞、大脑、肝、肺、骨骼肌、肾等 组织中均不表达。在胎儿中，TSARG4基因在胎脑中高表达，在睾丸 和卵巢中表达量极低。以上结果说明，成年人中，TSARG4基因是一 个睾丸特异性的基因。 (二)TSARG4基因在人类不同发育阶段的表达研究 RT-PCR结果表明，TSARG4 mRNA在胎儿睾丸中表达很弱，在青 春期和成熟男性睾丸中大量表达，到老年表达量下降。组织原位杂交 和免疫组化结果表明，TSARG4 mRNA在人睾丸中的精母细胞和圆形 精子中高表达，而在伸长的精子和成熟精子中均不表达。在胎儿睾丸 中没有TSARG4明显的杂交信号，在成人中删RG4则大量表达，到老 年期表达量下降。精子RT-PCR结果表明，TSARG4基因在成人排出的 精子中不表达。以上结果说明，TSARG4基因在精子发生的减数分裂 阶段发挥作用，与人类性成熟有关。 (三)TSARG4基因在人隐睾中的表达研究 对一例24岁双侧隐睾患者和一例睾丸癌患者进行检测，RT-PCR、 原位杂交及免疫组化结果表明，硎尺G4在隐睾中表达量明显低于正 常人，说明TSARG4基因在隐睾中是表达下调的。 第三章SRG4基因的克隆与序列分析 从已知功能的大鼠精子尾部基[]Spa94(sperm antigen 4)出发， 在小鼠dbEST数据库中同源搜寻与大鼠印刚基因编码氨基酸有较 II 高阉源穗的表遮序确豁记，褥弼耐个在小鬣鞲避缳艟中表懿EST 高阉源穗的表遮序确豁记，褥弼耐个在小鬣鞲避缳艟中表懿EST BGt00990翻BGl01t30。透过嵇惑分橱褥囊～个长蠹1155 bp躺片 段，该片段囊攒了小鬣皋丸骰怒基戮AK006225薛全部廖罗l，我们将 该蓥瓣俞鞠为SRG4(SpermatogenesisRelatedGene4，SRG4必GenBank 登容号为：AY307077)。挺定编码348个