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发光免疫分析法Luminescence Immunoassay 一．概论 免疫性是动物在长期进化过程中逐渐发展起来的防御感染和维护机体完整性的十分有效而灵巧的手段。 免疫系统的特殊功能是识别“自我”和“非自我”的物质，对自身的物质不起反应，而对外源的及体内改变了的物质则能起专一的免疫反应，排除其对机体的危害。另一方面，免疫系统还担负着维持机体免疫状态的自身稳定性，以清除体内衰老和突变的细胞。 1．抗体和抗原（Antigen , Antibody） 免疫学的重要对象是抗原和抗体的反应问题。 抗原是一种外来物质，当其进入动物体内能引起抗体的产生，并能和抗体反应的物质。 抗体 (antibody . Ab) 与抗原 (antigen . Ag) 的结合具有极高的专一性和亲合性。 不能诱导产生抗体，但能和适当抗体起反应，即有免疫反应性的简单分子称为半抗原。 ? （1）抗原 蛋白质，多糖，核酸，合成多肽，低分子物质 （2）抗体 抗体是一种蛋白质（主要是γ-球蛋白质） 血清蛋白质在自由电泳场中 白蛋白 α-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 抗体存在于β -球蛋白和γ -球蛋白内 这些蛋白质称为免疫球蛋白 IgM . IgA . IgG . IgD和IgE γM .γA.γG.γD.γE 2. 放射性免疫分析（RIA） 1959 Berson和Yallow 将免疫反应与分析化学相结合创立了放射性免疫分析法。 荷尔蒙的测定 先将荷尔蒙注入天竺鼠体内 对抗此抗原的抗体（Ab） Ag* + Ab === Ag*-Ab 要测定一病人的血清标本中荷尔蒙的浓度， Ag + Ag*-Ab === Ag-Ab + Ag* ( + Ag*-Ab ) 测定Ag*，可计算标本中所含有的荷尔蒙（Ag）浓度 1977 获诺贝尔医学生物学奖 分析对象： 测量含量很低的生物活性化合物： 如蛋白质（酶，接受体，抗体） 激素（甾族化合物，甲状腺激素，酞激素） 药物及微生物等。 优点：专一性强，灵敏度高 缺点： ①放射性同位素可能损害人们的身体健康，以致于实验室要有特殊防护技术 ②该法还需要用贵重的闪烁计数器和试剂 ③稳定性-同位素的寿命相对较短 ? 3 酶免疫分析法 用酶标记抗原或抗体 例：酶联免疫法测定氯霉素 微量反应板——羊抗兔IgG抗体 兔抗氯霉素抗体+氯霉素酶结合物 +氯霉素样品 没有结合的酶结合物被洗去，再向相应孔中加入过氧化氢和邻苯二胺，作用一定时间后，结合后的酶结合物将无色的邻苯二胺转化为蓝色的产物，加入终止液后颜色由蓝变黄，用波长450nm（双波长时最适参考波长≥600nm）酶标仪进行检测，吸光值与样品中氯霉素含量成反比。 酶不稳定、光度分析线性范围窄 4.发光免疫分析法 荧光免疫分析法 化学发光免疫分析法 以荧光物质或化学发光反应物质作为标记物。 优点： 专一性强 灵敏度高 稳定性好，可避免放射性污染 标记物不同，因而检测方法也不同 二．荧光免疫分析法 Fluonescense Immuuoassay 1．荧光探针 （1）??? 一般要求 a 检测最常遇到的样品为血清，它有很高的荧光背景。 血清蛋白 λem 325-350 nm (λex 280 nm) 血清中NADH和胆红素 430-470 nm (λex 330-360 nm) 探针λem 500 nm b. 荧光探针的斯托克斯位移 〉 50 nm c. 荧光探针的摩尔吸光系数要大 荧光产率应尽可能高 d. 荧光探针要稳定，且联结于抗体或抗原 时不应损害它们的活性 e. 荧光探针的激发波长应位于可见光区，因为较长波长处荧光杂质较少 λex 应位于vis区 (2) 有机探针 荧光黄 常用的探针 荧光产率高，有较好的光稳定性和低的温度系数。其缺点是斯托克斯位移较小。 在碱性的条件下，荧光黄与免疫球蛋白IgG的自由氨基起反应. ? 罗丹明类化合物 广泛用来标记抗体 和荧光黄相比，其荧光产率不如荧光黄，可是其发射波长较长，样品背景干扰较少。此外，罗丹明类亦常作为能量转移的接受体。 (3)? 金属螯合物 某些稀土金属离子会与某些配位体生成会发强荧光的配合物。 如：Eu(Ⅲ), Tb(Ⅲ), Nd(Ⅲ)与 β-二酮衍生物