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硕士学位论文高压干燥保存小鼠心脏的机制研究 硕士学位论文 高压干燥保存小鼠心脏的机制研究 摘要 目的终末期心脏病的治疗方法中，心脏移植无论是从病人的治愈率还是 病人的术后生存时间来看，都是无可非议的，甚至是最好的。等待接受心脏移 植的患者数量每年都在增加。供者来源少，受者数量却增加，对供心的要求就 越来越急迫。常用心脏保存液保存离体心脏限制在4．-一6 hil，z】，离体供心保存时 间短，限制了心脏移植手术的开展。通过改良保存液的成分，如加入钙离子、 抗氧化剂铮s】可以减轻保存过程中对供心的损伤，但效果仍不理想。如若找到 一种全新的离体器官(心脏)保存方法，在保证保存质量的同时大大延长保存 时间，可缓解目前供心紧缺的现状，造福广大复杂先天性心脏病和终末期心脏 病的患者。本实验课题采用一氧化碳(Carbon monoxide，CO)高压干燥保存这 一全新的器官保存方法，用以保存小鼠离体供心，观察一氧化碳和氧气混合气 体的高压干燥保存方式是否优于目前常用的康斯特保护液(HistidiBe Tryptophan Ketoglurate Solution，HTK液)浸泡保存，并对该保存方式的可能作 用机制进行探讨。 方法一SPF级C57BL／6雄性小鼠，84只。供体鼠4．-一6周龄，体重(21+2) g，共48只；受体鼠6．-一8周龄，体重(29士2)g，共36只，所有实验用鼠均购 自中山大学实验动物中心，饲养在屏障环境内。供体鼠随机分为4组，每组12 只：空白对照组、 即刻移植组、HTK浸泡保存24移植组(HTK组)及CO高 压干燥保存24 h移植组(CO组)。受体鼠随机分为3组，每组12只：即刻移 植受体组、HTK受体组及高压干燥受体组。 供体小鼠处理：小鼠术前均不禁食禁水，称重后，10％戊巴比妥钠腹腔注 射麻醉，麻醉成功后剪开腹壁，下腔静脉予以暴露，4℃肝素水l mL(100 u／mL)， 万方数据 摘要经下腔静脉注射。剪开胸壁及膈肌，向心脏以1 摘要 经下腔静脉注射。剪开胸壁及膈肌，向心脏以1 mL注射器缓慢注射高钾停搏 液，直至心脏完全停止跳动。分离心脏和肺脏周围组织，将心肺联合取下并迅 速放入4℃装有肝素生理盐水的塑料培养皿中。 供心处理：空白对照组取心后不做移植，马上取材进行相关检测；HTK保 存组则是15 mL 4。CHTK液中保存24 h；高压干燥保存组则是处理完供心后悬 挂于已预冷至4℃的干燥高压保存罐内。往罐内注入800 hPa的CO及3,200 hPa 的02，密封后将罐置于4C冰箱中保存24 h，注意高压灌内气体变化并及时补 充气体。 同系小鼠颈部异位心脏移植模型建立：受体鼠6～8周龄，按供体鼠处理方 法麻醉满意后仰卧位固定。采用改良cuff方法进行小鼠异位心脏移植术。分离 静脉残端多于组织，将静脉残端修正后穿入静脉套管，然后后翻呈袖套样套于 套管壁上，lO．0丝线套扎固定。移植后观察供心2 h，记录供心复跳情况质地及 颜色变化等。记录供心复跳率；依据复灌后供心的收缩强度、颜色及供心的硬 度进行移植物活力评分，2 h观察完毕后，缝皮，受体鼠置于电热毯保温、独笼 饲养。 术后供心取样检测：空白对照组小鼠取心后即刻送检，即刻移植组、HTK 保存组、高压干燥保存组于移植后24h取心送检。苏木精一伊红 (hematoxylin．eosinstaining，HE)染色法进行组织切片的染色，观察切片病理变 化情况，缺口末端标记法(Terminal．deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，Tunnel)检测凋亡细胞，进行凋亡细胞计数(高倍显微镜下)，免 疫印迹法(Westem．blot，WB)检测自噬标志性蛋白微管相关蛋白1．轻链3．II (Microtubule．associated protein 1 light chain 3．II，LC3．II)及B细胞白血病／淋 巴瘤．2(B cell lymphoma／leukemia-2，Bcl．2)蛋白。 结果供心移植后复跳率结果为：即刻移植组有9只复跳(n．12)、HTK 保存组有1只复跳(n=12)，高压干燥保存组有8只复跳(n=12)，复跳率结 果分别为75％、8．3％、66．7％，组间差异有统计学意义(，=12．667，P=0．0020．01)， 万方数据 硕士学位论文调整检验水准0【’=a／3=0．0167，多样本间行两两比较，即刻移植组与高压干燥保 硕士学位论文 调整检验水准0【’=a／3=0．0167，多样本间行两两比较，即刻移植组与高压干燥保 存组复跳率差异无统计学意义(P=O．6530．0167)，高压干燥保存组复跳率明 显高于HTK液保存组(P=0．0030．0167)，即刻移植组