成人原代肝细胞的分离鉴定及其蛋白质合成与p450表达内科学专业论文.docxVIP

分类号—— 分类号—— 密级—— 学校代码!Q墨垒2 学号 2Q12Q22Q!三2垒 成人原代肝细胞的分离、鉴定及其蛋白质合 成与P450表达 Isolation、identification and the protein synthesis of adult primary hepatocyte，and the expression of P450 指导教师姓名、职称 虚堂旦』 塾撞 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一五年五月 万方数据 中文摘要目的：探讨手术切除的成人良性病变肝叶的肝细胞分离及细胞鉴定 中文摘要 目的：探讨手术切除的成人良性病变肝叶的肝细胞分离及细胞鉴定 技术，研究成人原代肝细胞培养过程中的细胞活力的改变，及蛋白 质合成与细胞色素P450表达的变化。 方法：选择肝脏良性病变的手术切除肝叶标本，采用改良胶原酶灌 注分离法分离肝细胞，用血球计数板计数法对分离后的新鲜肝细胞计 数，台盼蓝拒染法检测新鲜肝细胞活率；利用过碘酸-schiff(PAS) 反应来检测肝细胞的糖原合成能力，并利用免疫组织化学方法来测定 肝细胞角蛋白CKl8的表达联合判断肝细胞纯度；用CCff一8法检测连 续培养7d肝细胞的细胞活力；全自动生化分析仪检测成人原代肝细 胞在培养过程的白蛋白、尿素合成及相关生化功能指标；应用蛋白质 印迹法(Western Blot)检测体外培养肝细胞细胞色素P450表达(生 物转化反应第一相反应)。 结果： 1．新鲜分离的成人原代肝细胞数目大于109个，台盼蓝拒染法检 测肝细胞活率达90％或以上。 2．培养24小时后，肝细胞PAS糖原染色发现成人原代肝细胞内 糖原被染成红色颗粒或片状，抗细胞角蛋白CK一18免疫组织化学染 色发现CK一18在肝细胞内均匀分布，被染成棕黄色；糖原染色及细 胞角蛋白CK一18联合鉴定肝细胞纯度达95％以上。 3．CCK一8实验结果显示肝细胞培养第三天细胞活力处于最佳状 太 √匕、o 4．培养的1周的过程中，肝细胞均具有良好的合成糖原、白蛋白 万方数据 和尿素的功能。 和尿素的功能。 5．培养过程中，ALT、AST、LDH的泄漏率呈下降后上升的趋势， 在培养3天时达到最低，培养4天时开始上升，白蛋白的分泌量和 尿素合成量在培养3天时达到最高，培养4天时开始下降。 6．在离体培养1—7天中，肝细胞在80KD处均可见有细胞色素 P450表达，并且在第3天表达最好。 结论： 1．改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞操作步骤简单，得到的肝细 胞数目多、纯度高且具有完善的细胞功能。 2．本研究所示肝细胞的细胞活力及细胞的生化性质均在培养的 第3天时达到最好的状态。 3．在离体培养l周的过程中，成人原代肝细胞均具有很好的细胞 色素P450表达功能，且在第3天表达最好。 关键词：成人原代肝细胞；鉴定；P450表达 万方数据 I I SO I at i on、i dent i f i cat i on and the p rote i n synthes i S of adu I t pr i mary hepatocyte，and the express i on of P450 Abstract Objective：To explore the hepatocyte isolation and the identification technology of adult benign lesions of liver resection operation of leaves，To study the changes of cell viability in the culture process of adult primary hepatocyte，and the Changes in protein synthesis and cytochrome P450 expression Method：Isolate hepatocytes from the livers of patients with benign lesion with surgical excision，using the trypan blue staining method to detect fresh liver cell survival rate；Periodic acid Schiff(PAS) attaining was performed to evaluate the status of hepatic glycogen storage，combining with the immunocytochemical staining targeting cytokeratin 1 8(CK一1