第五章基因的定点突变.PDFVIP

第六章 基因突变技术 Creating Mutations 1  Naturally occurring mutations  Erroneous DNA replication, 10–6~10–8  Artificially increasing mutation rates  Physical mutagens: X-rays, UV light  Chemical mutagens: EMS, NTG 2  Drawbacks of traditional mutagenesis  The mutations produced are random  The observed phenotypic change may not be a result of a mutation within the single gene  For example, alkaline protease gene of B.pumilus 3 第一节 基因定点突变 Site-directed Mutagenesis  在体外特异性改变某个碱基的技术  研究基因的结构与功能的关系  获得所需功能的突变体蛋白质 4 1. 寡核苷酸盒式诱变 Cassette mutagenesis 利用一段人工合成的具有突变序 列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒， 取代野生型基因中的相应序列 5 6 2. 寡核苷酸引物延伸 Primer Extension Mutagenesis ①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的寡 核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成 部分，因此所产生出来的新链便具有已 发生突变的碱基序列 7 The use of oligonucleotides in creating site-directed mutations was devised in the laboratory of Michael Smith, who shared the 1993 Nobel Prize in Chemistry for his discovery. 8 作为诱变剂的寡核苷酸序列：  人工合成一段25个碱基以上的寡核苷 酸序列，该序列中除了所需的碱基突变 外，其余的则与目的基因编码链的特定 区段完全互补  错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位  引入的错配碱基越多，两侧完全匹配的 序列就要越长 9 ②基本步骤：  将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体 上，制备单链DNA  将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火， 在DNA聚合酶作