双酰胺类杀虫剂抗性与敏感品系小菜蛾差异性cdna及鱼尼丁受体基因分析植物保护专业论文.docxVIP

关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》并向社 会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 鸯f闽 导师签名： 监阶哆 日 期： 万方数据 目 目 录 中文摘要 ．I Abstract ． ． ．．III 1弓I言 ．1 1．1双酰胺类杀虫剂的研究概况 一l 1．1．1氯虫苯甲酰胺概述 1 1．1．2氟虫双酰胺的概述 1 1．2小菜蛾抗双酰胺类杀虫剂的研究进展 ．3 1．2．1小菜蛾的发生及危害 一3 1．2．2小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗药性研究现状 ．．3 1．2．3小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗药性机制研究现状 4 1．3昆虫抗药性基因表达差异分析方法 ．4 1．3．1 cDNA代表性差异分析(cDNA RDA) ．4 1．3．2 mRNA显示技术(DDRT) 5 1．3．3基因表达系统分析(SAGE) 6 1．3．4抑制性消减杂交(SSH) 6 1．3．5 eDNA微阵列(cDNA Microarray) ．．6 1．3．6双向电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis) 7 1．3．7高通量测序技术 一7 1．3．8几种差异表达分析方法的比较 。7 1．4选题目的和意义 ．9 1．5本研究的技术路线 10 2材料与方法 1l 2．1供试药剂、试剂和主要仪器 11 2．1．1供试药剂与化学试剂 11 2．1．2主要分子试剂 11 2．1．3主要仪器 ．，．． ．．12 2．2供试昆虫与饲养 12 2．2．1供试昆虫 ．．12 2．2．2试剂及培养基的配制 13 万方数据 2．3毒力测定及抗性选育 2．3毒力测定及抗性选育 14 2．4分子试验方法 14 2．4．1小菜蛾抗性品系与敏感品系的cDNA代表性差异分析 14 2．4．1．1小菜蛾RNA提取 ．．14 2．4．1．2小菜蛾总RNA纯度检测一分光光度法 ．．15 2．4．1．3小菜蛾总RNA完整性的鉴定一琼脂糖凝胶电泳 ～l 5 2．4．1．4小菜蛾mRNA的纯化 16 2．4．1．5小菜蛾双链cDNA的合成 1 7 2．4．1．6制备检测子及扩增子 ．1 8 2．4．1．6．1扩增eDNA 19 2．4．1．6．2制备Driver 19 2．4．1．6．3制各Tester ．1 9 2．4．1．7消减杂交 一20 2．4．1．8差异片段的纯化、连接转化与测序 一20 2．4．2小菜蛾基因突变的检测 22 2．4．2．1小菜蛾RNA提取、逆转录及PCR扩增 ．22 2．4．3不同品系小菜蛾对RvR的表达量 24 2．4．3．1荧光定量PCR的引物设计 24 2．4．3．2荧光定量PCR ．24 2．5数据处理与分析 25 3结果与分析 。26 3．1氯虫苯甲酰胺对三种小菜蛾品系／种群的毒力测定 26 3．2氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺对小菜蛾抗性选育 26 3．3小菜蛾cDNA代表性差异分析 28 3．3．1 RNA的提取和cDNA的合成 28 3．3．2 eDNA RDA差异片段的获得 29 3．3．3差异性片段的测序结果 30 3．3．4差异性片段的核酸及蛋白质的比对结果 32 3．4小菜蛾鱼尼丁受体(PxRYR)C末端突变位点的克隆及检测 34 3．4．1基因克隆与序列比对 34 II 万方数据 3．5 3．5 RYR在不同品系／种群小菜蛾中的表达量 37 3．5．1扩增效率 37 3．5．2不同品系小菜蛾RyR基因的表达量 38 4讨论 ．．4l 4．1 cDNARDA在获得小菜蛾差异性基因中的应用 41 4．2细胞色素P450基因的分析 ．．41 4．3鱼尼丁受体基因突变频率检测 42 4．4不同品系RYR基因表达量的检测 。43 4．5有待继续研究的问题 43 5结论 ．．44 5．1小菜蛾对氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺抗性发展 44 5．2 cDNA代表性差异分析 44 5．3 RYR的基因突变检测 44 5．4不同品系RYR的基因表达量变化 一44 本文创新之处 45