生化与分子生物学实用技术课幻灯.pptVIP

引物a(划线部分为HindⅢ酶切位点)： 5′-GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCCATTGT-3′ 引物b(划线部分为BamHI 酶切位点)： 5′-ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGGCTGAG-3′ PCR产物末端限制酶切位点的切断情况 10×PCR反应缓冲液 5.0 ?l dNTP mix(2mmol/L) 4.0 ?l Ex Taq DNA聚合酶(5U/?l ) 0.25 ?l 引物 a (10pmol/?l ) 2.0 ?l 引物 b (10pmol/?l ) 2.0 ?l pCIS2-Akt1 5ng 加水至 50 ?l 应用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶，反应体系为50 ?l 94℃预变性1min，然后按照94℃ 30sec，63℃ 45sec，72℃ 1min，进行29个循环，最后72℃延伸10min 。 电泳检测 PCR结果 PCR产物的回收和鉴定 将上述PCR产物全部电泳，然后按照TaKaRa DNA凝胶回收试剂盒的说明书回收PCR产物。 电泳检测回收的PCR产物 二、PCR产物和表达载体的限制性内切酶酶切 1、酶切体系的组成及注意事项 内切酶：根据实验的目的选择限制性内切酶。对于基因克隆，选择粘性末端可提高连接效率。 DNA：DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含有过量的酚、氯仿、乙醚、大于10mmol/L的EDTA、SDS以及过量的盐离子浓度，以免影响限制性内切酶的活性。 反应缓冲液：每一种限制酶都有其一系列最佳反应条件，甚至来源于不同厂家的同一种限制酶的反应缓冲液也不尽相同，应该严格遵照产品说明书进行操作。 2、限制酶操作时应注意的原则： 限制性内切酶从冰箱中取出后，应置于冰中。一般总是在其它试剂加完后，再加入内切酶。 必须使用新的灭菌吸管，1个吸管不能反复使用，更不可交叉使用。 内切酶的容积不能超过反应总容积的10％，否则使甘油终浓度达到5％将会抑制酶在该体系中的活性。 酶应分装成小份。当切割大量DNA时，通常用延长反应时间来减少酶的用量。 同一种内切酶消化多个DNA样品时，应计算所需酶的总量，再将酶稀释液分配到各个反应管中，以减少酶液储存管的污染机会。 PCR产物(或pBluescript II/SK) 12μl 10×Y+/Tanqo（with BSA） 2μl HindⅢ(10U/ ?l ) 1.5μl BamHI (10U/?l ) 1.5μl 补水至 20μl 三、PCR产物与载体的连接 建立连接反应时注意： 1、温度。粘性末端的连接一般在16℃进行，以保证粘性末端退火及酶活性、反应速率之间的平衡。 2、酶量。 3、DNA量。载体与目的DNA的分子数比例一般为1:3。 四、重组体导入受体细胞 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) 在重组DNA技术中 转化：将质粒DNA或以它为载体构建的重 组子导入细菌的过程。 转染：病毒及其重组子导入真核受体细胞 转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞 真核细胞转染的方法 脂质体法 磷酸钙法 电穿孔法 DEAE葡聚糖法 显微注射法 转化步骤： 将60?l E. coli JM109感受态细菌 置于冰上溶化； 加入2 ?l重组体； 冰上放置30分钟， 42℃水浴90 秒，迅速放入冰中骤冷3分钟； 加LB培养基至1ml ，轻轻摇荡，37℃振荡培养1.5h，使得细菌恢复正常并让氨苄青霉素抗性基因表达。 五、重组体的筛选与鉴定 直接选择法: (1) 抗药性标记选择： (2) 标志补救：如蓝白筛选 (3) 分子杂交法：