噬菌体抗体库技术.pptx

噬菌体抗体库技术;1.噬菌体抗体库技术概述 2.噬菌体展示系统 3.噬菌体抗体技术的操作 ;治疗性抗体的发展经历了异源抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段。目前，人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向，而噬茵体抗体库技术的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台，并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。;噬菌体抗体库技术： 聚合酶链反应(PCR)扩增抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面展示技术,把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体。;构建的噬菌体抗体库根据其来源可分为2大类，一类为免疫抗体库，另一类为非免疫抗体库。 免疫抗体库的抗体基因来源于抗原免疫的个体，因此不需要很大的库容量即可从该类抗体库中筛选到针对某一抗原的特异性抗体。但由于免疫本身的限制性和偏向性，利用免疫抗体库制备针对弱抗原自身抗原及具有毒性抗原的抗体均无效,而且某一特定的抗体库只能产生针对特定抗原的抗体，不能作为一个广泛应用的平台。;非免疫抗体库包括天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。 天然抗体库是采用不经过免疫的淋巴细胞构建的抗体库,半合成抗体库是人工合成一部分可变区序列与另一部分天然序列组合构建的抗体库,而全合成抗体库是指抗体可变区序列全部由人工合成。非免疫抗体库的优点是抗体均来源于人类,是完全的人源化抗体,但亲和力通常较低,除非生成大量的抗体片段。;构建这种抗体库的原始材料是种系的VH和/或VL基因片段或者是重排的可变区片段,在这里,一个或多个CDR要进行随机重排。在人类的重链片段中,第一和第二个CDR是由种系编码的,基本上是具有规范结构的。而CDR3是通过D区和J区组合而成的,具有高度的多样性,长度可以从2个氨基酸到26个氨基酸不等,是抗体多样性和特异性的决定因素。因而,半合成抗体库是指用人工合成长度为5~8或6一巧个氨基酸的CDR3随机序列与人胚系可变区基因(含CDRI和CDRZ)重组而成,在体外模拟V(D)J重排所构建的抗体库。 ;（1）PCR技术的发展 为了大量扩增抗体基因片段，可设计一系列相应引物，根据抗体中某些序列的相对保守性，利用不同的PCR技术简单有效地扩增出全套抗体可变区基因。一旦多样的IgV区基因组能够扩增，从噬菌体抗体库中即能得到针对不同抗原的高亲和力抗体。 ;（2）利用大肠埃希菌成功分泌有功能的抗体片段 在抗体片段如ScFv和Fab的可变区基因序列的5‘端加入细菌的信号肽序列，抗体片段即可分泌到周质腔，并在那里完成折叠，成为有功能的蛋白质分子。 （3）有效筛选系统的建立 传统的筛选方法使用固相化的纯化抗原，依赖噬菌体颗粒对目的抗原的亲和力差异来获得较高亲和力的抗体。而目前，可以在体外用完整的固化哺乳动物细胞原核细胞和组织中的天然抗原筛选噬菌体抗体片段。 ;2. 噬菌体展示系统;2.1 丝状噬菌体生物学;2.1 丝状噬菌体生物学;2.2 噬菌体展示所使用的衣壳蛋白;主要衣壳蛋白pVIII;pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?;2.3 噬菌粒与辅助噬菌体;Helperphage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶。如果没有Helperphage，噬菌粒就像质粒一样进行扩增。 包装后的噬菌体含有两种不同来源的成分：噬菌体质粒和Helperphage。 使用野生型辅助噬菌体会导致噬菌体污染,使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段。 当有噬菌质粒时，由于噬菌质粒含有野生型M13或者f1复制起始点，因此，单链噬菌质粒的DNA会被优先包装并分泌。 ;2.4 多价展示与单价展示;多价展示会无法鉴定出筛选中亲和性最高的克隆，因为多价位会使弱结合性克隆具有高表观亲和性。单价展示可以保证基于单纯亲和性的筛选。反过来，在一些初始候选者的结合性非常低的应用中（如与一个给定靶标结合的多肽的从头筛选），多价位增加了分离出稀少的及弱结合性的克隆的机会。在这样的项目中，一个常用的实验策略就是以多价展示开始，然后当被展示多肽的亲和性成熟时，转为单价展示。;3. 噬菌体抗体技术的操作;首先提取细胞的总RNA,经过RT- PCR扩增可变区基因;单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面;3.3噬菌体抗体库的筛选;亲和筛选分为直接法和间接法。直接法是将蛋白质分子偶联到固相支持物上,文库噬菌体与固相支持物温育,洗去未结合的噬菌体,即获得亲和噬菌体。 间接法是将生物素标记的蛋白质分子与文库噬菌体温育后铺在结合有链亲和素的平皿上,洗去未结合的噬菌体,保留得到的结合状态的噬菌体。改变洗脱条件洗脱结合的噬菌体,用这部分噬菌体感染细菌,扩增后进行下一轮的筛选,通过反复几次筛选即可得到高亲和力的抗体。;（2）细胞筛选;（3）体内筛选;3.4影响抗体库筛选效率的因素;（3）温度