生物大分子的分离与制备2013..ppt

现代生化技术概论 教师：王爱英 副研究员 生命科学学院 邮箱：495684278@ 课 程 要 求 平时成绩占30%，包括考勤、课前提问10分；要求每位同学准备笔记本，记好每堂课的笔记，占20分。 期末考试占到70%，其中包括名词解释，填空，简答题，分析及其叙述题 借阅相关的书籍资料进行预习以及复习，奠定好基础。 课程讲述以专题的形式，涉及相关的实验技术以及生物化学与分子生物学相关技术的发展。 生物分子的结构与功能分析： 1. 蛋白质结构分析 2. 酶活力检测 3. 蛋白质组学分析 4. DNA序列分析 5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交 7. 基因克隆 8. 基因组文库构建 9. cDNA文库构建 10. 文库筛选 11. 报告基因检测 12. 基因芯片 13. 基因敲除 14. RNAi 15. 转基因动物 生物大分子相互作用分析: 生化反应过程实际上是生物分子间的相互作用过程。生物大分子间的相互作用是它们的功能基础。随着分子生物学研究的进展，建立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技术。 生物大分子相互作用分析技术: 凝胶阻滞分析法 DNA酶Ⅰ足纹分析法 蛋白质芯片 酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质 第一章 生物大分子的分离纯化 蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。 蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能； 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋白质的合成。 生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢变化，如蛋白质和核酸的水解。 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 产物的浓缩，干燥和保存。 生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 注意事项 第一节：生物材料的选择 选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好；来源丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价值等。 生物材料一般可以分为两大类：天然生物材料和人工生物材料。 生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的生物个体、器官或组织。 人工生物材料又分为三种： 1、 新品种材料 2、组织培养材料 3、生物产品与生物制品材料 要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力。 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。 1、动物组织 保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。 a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：－10℃的冰箱内； 长期保存：－70℃低温冰箱内。 b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。 冰箱的除霜循环，可能对細胞造成伤害，要特別小心。解冻時要越快越好，但避免局部過熱。 第三节 生物大分子的提取 提取是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。 提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等。 溶剂提取法 原理:利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来。 影响溶剂提取效率的因素（影响溶解度的的因素） 1、溶剂的性质：（根据相似相溶原理） 2、离子强度：离子强度是影