eif4a3对流感病毒复制的影响及其作用机制研究预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文3．7 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．7 eIF4A3促进流感病毒聚合酶活性 28 3．8 eIF4A3促进流感病毒聚合酶组装 29 3．9 elF4A3促进流感病毒NP的核输出 ．31 3．10 eIF4A3功能突变体对流感病毒增殖的影响 ．．31 第4章讨论 ．．33 第5章小结 ．．35 参考文献 ．36 致谢 ．．46 II 万方数据 elF4A3对流感病毒复制的影响及其作用机制研究摘要 elF4A3对流感病毒复制的影响及其作用机制研究 摘要 流感病毒属于正粘病毒科的单股负链RNA病毒，基因组分为八个节段，其中 编码PA、PBl、PB2和NP蛋白的基因高度保守，且它们与流感病毒vRNA结合以 后形成vRNP，主要负责流感病毒的转录与复制。流感病毒与宿主细胞相互作用构 成了病毒感染、复制、致病及免疫的分子基础。因此，理解宿主因子与流感病毒的 相互作用不仅有利于我们深入了解流感病毒生活周期，也有利于开发新的抗流感药 物。 本实验室在前期的研究中通过串联亲和纯化实验筛选到与聚合酶复合物互作的 宿主蛋白elF4A3(Eukaryotic translation initiation factor 4A isoform 3)。并且本研究证 实该蛋白可以与流感病毒聚合酶亚基PBl相互作用，进一步发现该蛋白能够显著促 进流感病毒的增殖，促进流感病毒的转录与复制。探究该蛋白促进流感病毒增殖的 作用机制时我们发现elF4A3过表达时可以促进流感病毒聚合酶活性，而且这种促 进作用是通过提高聚合酶系统组装实现的。同时，elF4A3干扰时可以显著抑制流感 病毒vRNP核输出。这不仅拓展了现有的流感病毒与宿主因子相互作用网络，也为 以后流感的防控提供了新的思路和方向。主要研究结果如下： 1 elF4A3促进流感病毒增殖 本实验室在前期的研究中通过串联亲和纯化实验筛选到与流感病毒聚合酶复合 物互作的宿主蛋白elF4A3，通过检测elF4A3干扰之后对PR8及HM流感病毒mRNA 水平的影响，初步确定了elF4A3干扰之后可以显著抑制流感病毒复制。进一步通 过TCID50实验验证elF4A3对流感病毒增殖的影响，结果与上面一致，即elF4A3 干扰之后可以显著抑制流感病毒的增殖。 2流感病毒感染过程中，eIF4A3促进流感病毒转录，复制 在A549细胞上将elF4A3干扰和过表达之后感染HM，并于4h，6h，8h收样， 通过荧光定量方法检测eIF4A3对流感病毒mRNA，cRNA和vRNA水平影响，同 时通过Western检测该蛋白对流感病毒蛋白表达的影响。结果证实该蛋白在干扰之 后可以显著抑制流感病毒复制，转录，过表达时能够显著促进流感病毒转录，复制。 3 elF4A3可以和流感病毒聚合酶亚基PBl相互作用 通过Co—IP实验我们发现elF4A3能够与流感病毒聚合酶亚基PBl发生相互作 用，而与其它亚基不存在相互作用，且在感染情况下elF4A3与内源性PBl也存在 相互作用；进一步通过激光共聚焦显微镜ZEISS检测PBl与elF4A3的亚细胞定位 情况，发现两个蛋白在空间上存在共定位，主要定位于胞核。 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 4 eIF4A3促进流感病毒聚合酶活性 用293T细胞检测elF4A3干扰与过表达时对流感病毒聚合酶活性的影响，发现 该蛋白过表达可以显著促进流感病毒聚合酶活性，干扰之后可以显著抑制聚合酶活 性。 5在聚合酶系统中，eIF4A3可以促进流感病毒聚合酶系统组装 探究elF4A3促进流感病毒聚合酶活性的原因，我们首先将elF4A3过表达293T 细胞，24小时后Western检测该蛋白对流感病毒聚合酶各个亚基及NP蛋白表达水 平的影响，发现该蛋白对各个蛋白表达均没有影响，进一步通过Co．IP实验检测 elF4A3对该聚合酶系统组装的影响时发现，与对照相比，elF4A3可以显著促进流 感病毒聚合酶系统RNP组装。 6 elF4A3干扰之后抑制流感病毒vRNP的核输出 将elF4A3干扰之后接毒HM，并于5h之后进行固定，透化，染色，利用激光 共聚焦显微镜观察发现eIF4A3干扰之后可以显著抑制NP蛋白的核输出。 7 elF4A3蛋白解旋酶功能在它对流感病毒影响中发挥重要作用 为研究eIF4A3蛋白解旋酶功能在它对流感病毒影响中发挥的作用，我们将该 蛋白DEAD区域进行突变，通过相对荧光定量方法检测该区域突变后对流感病毒复 制的影响，结果发现elF4A3突变之后，该蛋白对流感病毒促进作用消失，变为抑 制。 关键词：流感病毒；elF4A3；PBl；Co-IP；聚合酶活力；RNP组装；核输出 万方数据 elF