超分子免疫磁珠定量pcr技术的建立及大肠癌转移相关标志物的探讨病理学专业论文.docxVIP

博士学位论文超分子免疫磁珠定量PCR技术的建立及大肠癌 博士学位论文 超分子免疫磁珠定量PCR技术的建立及大肠癌 转移相关标志物的探讨 博士研究生：李祖国 指导教师：丁彦青教授 摘要 大肠癌是一种常见恶性肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势，目前在我国恶性肿 瘤中列第五位、在欧美发达国家列第三位。尽管近些年临床对大肠癌的诊治水平 有明显提高，但大肠癌的病死率仍居高不下，其主要原因是大肠癌较难被早期发 现，大部分患者到中晚期才被发现，错过了手术的最佳时机，复发和转移仍是患 者死亡的主要原因。因此，阐明大肠癌发生和转移机制、发现新的大肠癌特异性 标志物、研究新的标志物检测技术以及对标志物的作用机制的研究成为目前该领 域研究的热点课题。 大肠癌是在环境和遗传因素共同作用下，经历多基因，多步骤、多阶段复杂 的生物学过程演变而来。大肠癌发生发展的经典模式是：结直肠上皮细胞增生一 腺瘤一非典型增生一癌一转移癌。在大肠癌发病过程的不同阶段，肿瘤细胞由于 基因组改变产生一些肿瘤相关和／或肿瘤特异的小分子蛋白质／肽，分泌某些细胞 因子或相关抗体，这些物质可释放到血液中，形成大肠癌血清肿瘤标志物。目前 已证实有许多癌基因和抑癌基因如环氧化酶2基因、P53基因等在大肠癌发病过 程中发生显著的变化，这些基因产物分泌到血液中，便可成为某些特异大肠癌血 清标志物。但由于血清是一种十分复杂和多样化的液态基质，尽管大肠癌发生后 可导致血清蛋白在结构和数量上发生某些特征性的变化，但由于目前我们对血清 蛋白的了解有限，只有很少一部分血清蛋白如癌胚抗原(CEA)、乳糖蛋白系列 (CAl25，CAl99)用于常规的临床诊断，而其它大肠癌相关基因产物如环氧化酶 中文摘要2等能否作为大肠癌标志物仍需进一步研究，并且由于目前的检测手段的限制， 中文摘要 2等能否作为大肠癌标志物仍需进一步研究，并且由于目前的检测手段的限制， 大肠癌标志物的检测结果特异性不高、敏感性较差，不能满足临床监测大肠癌的 要求。 鉴于目前临床还没有非常好的大肠癌血清标志物监测技术，还需要开发更灵 敏的检测技术，发现更多有临床诊断价值的标志物并明确这些标志物的作用和意 义。本研究首先应用免疫磁珠捕俘技术和免疫PCR技术以及荧光定量PCR的原理， 设计并建立一种新的适合血清微量标志物的检测方法一超分子免疫磁珠荧光定量 PCR技术。然后，用这种技术方法检测本课题组前期研究中筛选出来的大肠癌转 移相关基因环氧化酶2基因在大肠癌患者血清中的表达情况，并深入研究环氧化 酶2在大肠癌发生发展和转移中的作用并分析其作为大肠癌转移标志物的可行 性。最后，利用整体成像可视化大肠癌原位移植转移动物模型及蛋白质组学技术， 鉴定大肠癌不同发病时期血清中的差异表达蛋白，寻找新的大肠癌及转移相关标 志物。实验方法和结果如下： 第一章建立大肠癌微量血清标志物检测新技术一超分子免疫磁珠定量PCR技术 实验前选择大肠癌经典标志物癌胚抗原(CEA)作为理想的大肠癌标志物， 采用已知浓度纯化癌胚抗原作为实验标准品，采用羊抗兔IgG标记的Dynabeads M-280 Sheep Anti—Rabbit IgG免疫磁珠作为固相免疫捕俘剂。设计一对5’端 标记有生物素的能特异扩增深海水母特有的绿色荧光蛋白基因片段的引物，用 该引物扩增pEGFP—N1质粒，将PCR产物通过凝胶回收试剂盒纯化，获得一段 289bp生物素标记的深海水母特有的标志DNA片段。然后将生物素标记的DNA片 段与等摩尔分子的链卵白素和等摩尔分子生物素标记的大肠癌标志物抗体(生 物素标记鼠抗CEA抗体)进行交联结合形成一种超分子复合物，通过PALL— MicroseplOOk超滤装置(内含Omego PES膜)将超分子复合物进行过滤纯化， 并通过原子力显微镜对超分子复合物进行分析鉴定后得到线性化的纯超分子复 合物。制成超分子复合物后开展技术平台的构建：先在反应体系内依次加入 II 博士学位论文Dynabeads 博士学位论文 Dynabeads M一280 Sheep Anti—Rabbit IgG免疫磁珠、兔抗CEA抗体和血清肿瘤 标志物癌胚抗原(CEA)，通过免疫磁珠特异性吸附将血清中的标志物捕俘，然 后加入超分子复合物，由于该复合物中的生物素化抗体能与捕俘的血清标志物 特异结合，其中的模板DNA又能作为免疫荧光PCR的模板进行PCR扩增反应； 将反应体系中的复合物经磁力清洗装置反复清洗，去除未结合的杂物，加入荧 光定量PCR反应体系，通过PCR扩增反应将结合模板信号进行指数级放大，通 过计算反应体系中原始模板的量推测反应体系中的标志物的含量，达到快速高 效定量检测血清微量蛋白的目的；通过反复的实验和摸索，我们对系统进行优 化，确定了整个实验技术平台的方法和流程，建立了一套快