实验八.人类染色体核型分析.pptVIP

实验九. 染色体分带技术 实验目的和要求 了解染色体G带制备的方法和基本原理。 掌握染色体G带的染色技术。 了解染色体C带制备的方法和基本原理。 掌握染色体C带的染色技术。 实验原理 G带的形成与Giemsa染料的组成几染色特性有关。 Giemsa染料是由亚甲蓝，天蓝和伊红组成的复合染料，除伊红外，均为噻嗪类染料，它只与DNA中的PO43-基结合而不与蛋白质结合，所以染色体着色首先取决于两个噻嗪分子与DNA的结合，其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。染色体上高浓度疏水性蛋白的区域有利于噻嗪-伊红沉淀物的形成，这些区域相当于含高比例二硫键的氧化态蛋白质区域，经一系列处理后显示暗带，而另一些区域则为含巯基的还原态蛋白质，为亲水性蛋白质，对染料亲和力低，所以不显色。 实验用品 主要仪器： （1）? 超净工作台 （2）? 大容量低速离心机 （3）? 二氧化碳培养箱和电热恒温培养箱 （4）? 电热恒温干燥箱 （5）? 水浴锅 （6）? 天平 （7）? 显微镜 实验材料和试剂 材料：人或小鼠染色体标本 试剂：0.0125%胰蛋白酶（效价1:250，以生理盐水配制） 0.2M HCL Giemsa染液（1g Giemsa粉不断添加少量甘油充分研磨，甘油总量为60mL,倒入烧杯中于55-60oC水浴加热2小时，冷却后加入60mL甲醇，混匀后室温放置2-3天过滤，在棕色瓶中长期保存。 * Giemsa工作液（10%）需要新鲜配制（以蒸馏水或1/15M 磷酸缓冲溶液配制） 实验步骤 1，将老化3-7d的染色体标本先放入40-80oC温箱中预处理数小时或更长时间。 2，将预处理过的染色体标本浸入37oC 0.0125%胰蛋白酶溶液中，轻轻摇动3-15s。 3，取出标本，吸去多余的水分，放入1：10 Giemsa染液中染色15-20min。 4，自来水冲洗，晾干，镜检。 显微镜观察 在显微镜下，可见分布在染色体全长上的宽窄不同的相间条带。带纹的多少随染色体的不同而异，另外还与染色体所处的时期不同而有所差异，一般中期染色体带纹较少，早中期与晚前期染色体的带纹较多，前期染色体多呈颗粒状。 人类染色体G-带照片 染色体C带技术实验原理 C带技术是20世纪70年代初兴起的一项细胞生物学新技术，它借助特殊的处理程序，显示着丝粒处及其他部位的结构异染色质（constitutive helerochromatin），由此而得名。DNA分子经酸，碱处理可以发生不同的变化，酸处理可以使DNA分子脱嘌呤，碱处理可使DNA分子变性及溶解，2X SSC溶液的处理可使DNA骨架断裂并使断片溶解。在C带显带的过程中，染色体臂的DNA被酸碱盐选择性的破坏了，着色较浅，而C带区的DNA富含组蛋白，比富含非组蛋白的染色体臂的DNA结构紧密，从而保护了C带区的异染色质免受酸碱盐的破坏，使其容易着色，从而产生C带。 实验材料和用品 材料：人或小鼠染色体标本 试剂：0.2M HCL 2.5% Ba(OH)2：新鲜配制并经65oC热过滤 2×SSC（0.3M NaCL + 0.03M 柠檬酸钠） Giemsa染液 实验方法 将老化3-7d的染色体标本，在室温下用0.2M HCL处理30-60分钟。 用蒸馏水漂洗3次。 转入50oC 2.5% Ba(OH)2溶液中保温10-15min。 用自来水冲洗3-5min，再用温蒸馏水冲洗直到附着在载波片上的Ba(OH)2被冲洗掉。 将标本放到60-65oC 2×SSC溶液中处理60-90min。蒸馏水冲洗。 染色，镜检。 显微镜观察 在显微镜下，染色体的带纹呈深红或紫红色，染色体的无带区为透明或半透明的淡红色。 实验报告： 绘制人类染色体的G带和C带模式图。 比较染色体的G带和C带的差别，讨论它们在研究和临床上的应用价值。 制片质量的关键步骤是那些？ * * *