α鹅膏毒肽给药小鼠差异表达基因的鉴定及其拮抗药物的筛选遗传学专业论文.docxVIP

四川大学博士学位论文cL一鹅膏毒肽给药小鼠差异表达基因的鉴定 四川大学博士学位论文 cL一鹅膏毒肽给药小鼠差异表达基因的鉴定 及其拮抗药物的筛选 遗传学专业 研究生： 刘军 指导教师：杨志荣 摘要 四川省及四川周边地区因为其独特的地理和生态环境，具有丰富的蕈菌 资源。通过筛选富含Ⅱ．鹅膏毒肽物质的毒蕈，从中分离鉴定a一鹅膏毒肽，并 研究d一鹅膏毒肽在蕈菌的分布情况等，为进一步研究和生产a一鹅膏毒肽提供 理论基础。再通过分析Q．鹅膏毒肽在中毒小鼠体内的分布，初步探讨它在动 物体内的代谢情况。在毒蘑菇中毒事件的事发地采集到相关蕈菌，对其进行 小鼠毒性实验，证明其含有致死毒素，进一步对其进行形态学和分类学等研 究，确定为鳞柄白毒鹅膏菌。利用反相高效液相色谱法从中分离到了a一鹅膏 毒肽，此即为一种主要致死毒素。在本论文实验条件下，我们绘制出0t一鹅膏 毒肽浓度标准曲线及回归方程Y=5159X+1097．4。然后对鳞柄白毒鹅膏菌子 实体中的小鹅膏毒肽总含量及在子实体中的分布情况进行了研究，通过与标 准曲线及回归方程方程的对比和计算，结果显示旺．鹅膏毒肽总含量为 2833．8tIg／g干子实体。cc．鹅膏毒肽在子实体中的分布具有环境因子特异性和组 织特异性。论文对不同蕈菌采集地区的鳞柄白毒鹅膏菌中Ⅱ．鹅膏毒肽含量研 究发现，三江自然保护区的鳞柄白毒鹅膏菌中n．鹅膏毒肽含量最高，其次分 别为重庆綦江县、雅安市、大邑县和彭县。蕈菌子实体中各部分组织中*鹅 膏毒肽含量的研究结果显示，菌褶中a一鹅膏毒肽含量最高，约占c【．鹅膏毒肽 总量的51．09％，且在单位组分中，旺．鹅膏毒肽的量也最高，约至菌褶组分干 重的O．29％。论文对尾静脉给药半致死计量c【．鹅膏毒肽的小鼠的组织进行 RP—HPLC分析，结果发现，对动物体组织中a．鹅膏毒肽的分布和代谢情况的 VlI n—amanilin给药小鼠差异表达基因的克隆鉴定及且拈抗药物筛选研究具有时间依赖性，尾静脉给药48h后，血浆和脾脏中已经检测不到cc-鹅 n—amanilin给药小鼠差异表达基因的克隆鉴定及且拈抗药物筛选 研究具有时间依赖性，尾静脉给药48h后，血浆和脾脏中已经检测不到cc-鹅 膏毒肽，但在肝脏和肾脏组织中可检测到n一鹅膏毒肽积累。由此可见，毒素 伐一鹅膏毒肽在中毒一段时间后，对主要脏器肝脏和‘肾脏有直接的毒性作用。 运用现代分子生物学技术筛选u一鹅膏毒肽作用前后的差异表达基因，为研 究a一鹅膏毒肽作用机理、相关基因及临床诊断和拮抗药物筛选奠定基础；并 可以从不同角度、不同层次对Ⅱ一鹅膏毒肽的毒性作用进行理论阐释。用抑制 性差减杂交(SSH)技术构建了位一鹅膏毒肽作用前差异表达基因的差减cDNA文 库(正向差减文库)和正正常生理状态下差异表达基因的差减cDNA文库(反 向差减文库)。从差减cDNA库中随机挑耿400个克隆进行了PCR筛选，得到 166个差异表达cDNA片段。再通过斑点杂交筛选，得到85个阳性差异表达 cDNA片段，正向差减和反向差减差异表达cDNA片段分别为42和45个。随即 挑选9个cDNA克隆测序，将所测序列经GenBank检索，将所测序列与GenBank 中的基因序列进行同源性比较与分析，发现正向差减筛选到的基因片段分别 为AK013055、AK013732、NM 007645、N1“_013520、NM 016974、NM_021718： 反向差减筛选到的基因片段分别为D14716、NM NM 019946 在抑制消减杂交和基因芯片技术对甜鹅膏毒肽作用小鼠进行差异表达基 因研究的基础上，根据实验结果，选择具有功能代表性的几种差异表达基因， 然后运用半定量PCR技术筛选对Ⅱ．鹅膏毒肽作用具有拮抗作用药物，建立针 对旺．鹅膏毒肽毒性作用的拮抗药物的快速筛选方法。在待筛选拮抗药物干预 后，小鼠的临床症状出现不同的变化，尤其以水飞蓟素干预组、赤灵芝干预 组表现突出，这两个实验组小鼠与a一鹅膏毒肽中毒组相比，表现活跃，动作 迅捷。比较各实验组小鼠体重的变化数据，各组小鼠在d一鹅膏毒肽给药12h 后体重就出现了明显下降，双尾检验，差异及显著。水飞蓟索干预组、赤灵 芝干预组和苏麻组小鼠体重在药物干预至36h后，体重有了明显恢复，差异 不显效。半定量PCR实验结果显示，各种干预药物对Ct一鹅膏毒肽作用引起的 变化基因有不同水平的影响。，水飞蓟素、赤灵芝和紫苏／甘草对上调的基因 CatnB有明显的恢复下调，Cain B的转录量与内参B—actin比值分别为 0．71、0．80和O．85，远低予正对照组的1．28。水飞蓟素和赤灵芝干预对F1t3L 基因转录水平有上调作用，这两种药物干预后，Flt3L的转录量与内参 VIII 凹川大学博上学位论文D—acti 凹川大学博上