阿德福韦酯规范治疗停药后复发慢性乙型肝炎患者的病毒准种分析内科学专业论文.docxVIP

阿德福韦酯规范治疗停药后复发慢性乙型肝炎患者的病毒准种分析 阿德福韦酯规范治疗停药后复发慢性乙型肝炎患者的 病毒准种分析 摘 要 目的：口服核苷(酸)类似物(nucleot(s)ide analogs，NAs)是目 前持久抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的主要药物，NAs治疗后乙型 肝炎复发的问题越来越引起广泛重视。HBV在体内以准种的形式分布 和存在，准种多态性对停药后复发患者再治疗的疗效及病情转归有重 要影响。目前，对NAs治疗停药后复发再治疗的研究主要集中于拉米 夫定，对于阿德福韦酯等其他NAs的研究较少。国内临床研究仅提示 使用阿德福韦酯规范化治疗停药复发的慢乙肝患者再次使用阿德福 韦酯仍然有效，而对于复发患者体内乙肝病毒准种构成的研究则未见 报道。本研究以单用阿德福韦酯规范化治疗停药复发的慢性乙型肝炎 患者和未经过抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者为研究对象，全面分析 阿德福韦酯规范化治疗停药后复发患者体内病毒准种的准确构成；对 比停药复发患者与未抗病毒患者体内病毒准种构成的差异，为阿德福 韦酯规范化治疗停药后复发患者的再治疗提供病毒学依据。方法：收 集阿德福韦酯规范化治疗停药后复发的慢乙肝患者及未抗病毒治疗 的慢乙肝患者的血清，提取HBV-DNA；采用巢式PCR扩增HBV多 聚酶的逆转录区(reverse transcription．RT)基因，一部分PCR扩增产 物送至上海上妮technology公司直接测序，另一部分PCR扩增产物继 续行琼脂糖凝胶水平电泳，以分离目的DNA片段；胶回收纯化目的 DNA片段，将其连接到T载体上，转入处于感受态的TOPl0大肠杆 DNA片段，将其连接到T载体上，转入处于感受态的TOPl0大肠杆 菌中；X．gal．IPTG．AMP．LB琼脂平板筛选阳性克隆，每个样本挑取 30个阳性克隆，过夜培养后的茵液送至上海L／re technology公司测定 T载体上插入的目的DNA片段序列；测序结果由DNASTAR SeqMan 拼接去除无关序列，以进行进一步的序列分析，包括去除载体序列、 多序列比对、找出耐药突变位点、计算准种复杂度和准种多样性、进 化树分析等；采用SPSS 19．0对结果进行统计分析。结果： 1．停药 复发组(n=25)与未抗病毒组患者(n-1 6)的乙肝病毒准种中野生株 的比例均大于93．33％，野生株均为优势株。停药复发组中含有耐药突 变的克隆与野生克隆之比为10／740，未抗病毒组中含有耐药突变的序 列与野生序列之比为8／472，卡方检验得出P0．05，两组间的差异无 统计学意义。 2．停药复发组与未抗病毒组的准种复杂度Sn分别为0．974(0．044)和 0．922(0．081)，P0．05，两组间准种复杂度的差异无统计学意义。停药 复发组与未抗病毒组的准种多样性(d、dS、dN)比较， ．：P值分别为 O．171、0．237、O．197，均大于O．05，两组间准种多样性差异无统计学 意义。3．对慢性乙型肝炎患者的准种复杂度及准种多样性(d、舔、柳) 与血HBV-DNA水平进行Spearman秩相关分析，结果显示准种复杂 度及准种多样性与血HBV-DNA水平无相关性。4．所有样本中检测到 的已知耐药突变位点有：耐恩替卡韦的rtll69T、rtS202I、rtM250V， 耐拉米夫定的rtVl73L、rtLl80M、rtM204I／V，耐替比夫定的rtM204I， 耐阿德福韦酯的rtAl81V，未检测到rtTl84G、rtN236T突变。在未抗 病毒组的患者的血清中也能检测到如下已知的耐药突变：rtll69V、 病毒组的患者的血清中也能检测到如下已知的耐药突变：rtll69V、 rtAl81V、rtS202I、rtLl80M、rtM204I／V。仅在未抗病毒组患者的血 清中检测到1个含有阿德福韦酯耐药突变(rtAl81V)的克隆。5．巢式 PCR扩增的RT基因直接测序的结果中未发现已知耐药突变位点的存 在，均为野生株序列；而巢式PCR扩增RT基因TA克隆后测序的结果 中发现上述多种已知耐药突变的存在。6．停药复发组患者与未抗病毒 组患者在进化树中并无明显聚集特征，序列间遗传距离相近，均小于 O．04。结论：1．使用阿德福韦酯规范化治疗后停药复发的慢乙肝患者 体内准种中的优势株仍为野生株，与未抗病毒治疗的慢乙肝患者在准 种复杂度和多样性上并无统计学差异。停药复发患者再次使用阿德福 韦酯治疗仍然有效。2．未行任何抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者体内 仍然存在耐药突变株；TA克隆后测序与直接测序相比能更好的了解 体内病毒的组成及是否存在耐药突变。 关键词：阿德福韦酯；慢性乙型肝炎；复发；准种 T Thl n quasisluaslspecnes analysis