生物工程综合实验79539.docVIP

生物工程综合大实验 木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，其化学结构较纤维素复杂 得多，它是一?个以0?1,4■糖昔键相连的木聚糖主链上带着些不同的取代基如乙 酰基、阿拉伯糖基、4?0■甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的。 Endo-P-1,4-木聚糖内切酶(EC 3.2.1.8)简称木聚糖酶，是木聚糖降解过程 屮最关键的一个酶，也是被研究最多的一个半纤维素酶，随机水解木聚糖主干链 内部的卩?1,4■糖甘键，产生木寡糖、木二糖和少量木糖。 木聚糖酶在造纸工业、饲料工业、食品工业、低聚木糖的制备等领域具有重 要应用价值。 本实验主要以携带有编码极端耐热木聚糖酶基因的重组质粒的大肠杆菌工 程菌(JM109-pHsh-xy/2B)为对彖，利用它进行重组酶的发酵生产和分离纯化。 通过此次实验，希望同学们能对微生物发酵产酶的一般过程、酶活性的测定、酶 的提取和分离纯化有一个基木的认识和了解。 实验一木糖?吸光度标准曲线、蛋白质浓度?吸光度标准曲线制作 在研究酶的性质、酶的发酵生产、分离纯化和应用中需要经常测定酶的活性, 为了较准确的表示酶活力，必须建立一种简便灵敏的酶活性测定方法。 在酶的分离纯化和酶学性质研究中，经常要测定酶蛋白质的含量。Bradford 法是一种迅速可靠的通过染色法测定溶液中蛋口质浓度的方法。 1、 实验目的 掌握木糖标准曲线和Bradford标准曲线的制作方法 2、 实验原理 木聚糖酶的活性通常是测定其水解底物木聚糖后生成的产物的还原末端一 —木糖的增加量来进行的，而木糖的含量可以利用其与某些显色试剂(如DNS 试剂，PAHBAH)反应后生成在特定波长下有特异吸收峰的有色化合物，从而通 过分光光度法测出。 木实验屮，木聚糖酶活性的测定是以0.5%燕麦木聚糖为底物，利用对径基 苯甲酸酰脐(PAHBAH)与水解反应产生的还原糖反应生成的化合物在沸水浴 中显现出黄色，这种化合物在410 mn有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与产 物述原糖的多少有关，因此可检测410nm的光吸收值的大小计算酶活。 用分光光度法测定木聚糖水解产物还原糖的含量，先要制作标准曲线，然后 根据标准曲线查出述原糖的含量，最后根据产物的含量就可以计算出酶的活性。 因此，制作标准曲线是酶活性测定的一项基本技术。 Bradford法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一 定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝 色化合物，反应迅速稳定，反应化合物在465?595nm有最大的吸光值，化合物 颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。因此可检测595nm的光吸收值的 大小计算蛋白质的含量。 同样，测定某一种蛋白质的浓度时，也要先用已知浓度的一种蛋白质制作标 准曲线，然后根据标准曲线查出待测蛋白质的浓度。 3、试剂 标准木糖溶液： 准确称取经105°C烘至恒重的无水木糖lg,用蒸诸水定容至100ml (即1%),实 际应用时稀释到0.01% 邻苯二甲酸氢钾缓冲液: 准确配制0. 1 M pH5.8 (90°C)的邻苯二甲酸氢钾缓冲液500 ml,利用pH计 以NaOH调节到规定铺pH值 ③终止剂/显色剂PAHBAH： A: 0.5 M HC1 溶解的 5% (w/v)对％基苯甲酸酰胁(/?-hydroxybenzoic acid) 200 ml,配好后储藏于4°C冰箱 B: 0.5 M NaOH 1 L 使用时，将A与B按1： 4的体积比混合即为PAHBAH显色剂 ?Bradford 储存液： 100 ml 95%乙醇，200 ml 85%磷酸，350mg 考马斯亮蓝 G-250 可在室温下长期保持稳定 ?Bradford 工作液: 425 ml 双蒸水，15 ml 95%乙醇，30 ml 85%磷酸，30 ml Bradford 储存液 滤纸过滤后保存丁室温棕色瓶屮 ⑥标准蛋口质溶液： 以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，配制成1 mg/ml标准溶液，用吋可稀释。 4、器材 分光光度计、、电子天平、水浴锅、煮沸电炉、移液管、泡沫浮子若干、pH计、 磁力搅拌器冰水 木糖标准曲线的制作 木聚糖酶活性的测定是以0.5%燕麦木聚糖为底物，利用对轻基苯甲酸酰脐 (PAHBAH)与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色，具休方法是：反应 体系为600卩1,添加15卩1卿液到由300卩1 0.5%(w/v)燕麦木聚糖和285卩1 100 mM pH 5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液组成的已经在90°C下预热的混合液中，90°C下 保温10 min后，最后加入1.8 mL终止剂/显色剂PAHBAH终止反应。其混合物 在沸水浴屮加热10 min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410 nm下测其吸 收值。木聚糖酶活性单位定义