基因工程基础知识与基本技术概述.pptVIP

(1)原核生物基因组的特点 　　　　①具有操纵子结构；②编码序列在基因组中约占50％，远大于真核基因组，但又小于病毒基因组；③多顺反子结构且无内含子，是连续的Pg此转录后不需要剪切；④基因组中重复序列很少；⑤基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。 (2)真核生物基因组的特点 　　　①每一种真核生物都有一定的染色体数目；②真核生物的莱因织远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有很多复制起点，每个复制子大小不一；③真核生物都有结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反于，即一分子mRNＡ只能翻译成一种蛋白；④大量重复顺序的存在是真核生物基因组的重要特点；⑤真核生物基因组内非编码的顺序占90％以卜，基因组中的非编码的顺序所占比例是真核生物与细菌、病毒的重要区别，正在一定程度上也是生物进化的标尺；⑥大多数真核生物的结构基因具有内含子结构，是断裂基因，而原核生物基因不含内含子序列；⑥有基因家族，来自同一个祖先基因的复制和变异、功能相关的基因构成各种基因家族，可以串联在一起，亦可相距很远，。 原核与真核生物基因组特点 电泳技术 ＰＣＲ技术 分子杂交技术 ＤＮＡ序列分析技术 基因突变技术 1.２ 基因工程的基本技术 　　　电泳，指混悬于溶液中的样品电荷颗粒,在电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的现象。 1.2.1 电泳技术 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺电泳 琼脂糖电泳，就是用琼脂糖凝胶作支持物的电泳方法。 琼脂糖电泳 琼脂糖电泳的操作 正确选择凝胶浓度 适合的电泳缓冲液 电泳的合适电压和温度 DNA样品的纯度和状态 DNA的上样 Marker的选择 凝胶的染色和观察 　　使用聚丙烯酰胺凝胶作为基质,进行电泳的方法。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 非变性聚丙烯酰胺凝胶 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS） SDS电泳 SDS电泳 ，中SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 1.2.2 PCR技术 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 PCR技术的发现 1984年11月15日，PCR实验获得了成功 1985年3月28日，申请有关PCR的第一个专利 1985年9月20日，一篇关于PCR应用的文章关交《科学》杂志，11月15日接受发表。 1985年12月，一篇正式介绍PCR的原理的论文送到《自然》杂志，拒稿。后改投吴瑞为主编的《酶学方法》杂志。 1986年5月，穆利斯去冷泉港实验室举行的“人类分子生物学”专题研讨会上介绍PCR技术 1991年12月12日，霍夫曼－拉夫什公司出资3亿美元购买PCR技术。西斯特公司倒闭 1993年10月13日，穆利斯因发明PCR技术获诺贝尔化学奖。 ＰＣＲ技术实验过程 PCR实验原理图 ＰＣＲ反应的特点 特异性强 灵敏度高 能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板，扩增到微克(μg=10-6)水平 简便、快速 一般在2～4 小时完成扩增反应 ①引物与模板DNA特异正确结合； ②PCR反应遵循碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 第一章 基因工程基础知识与基本技术 1.1 基因工程的基础知识 1.1.1 基因的结构特点 基因按照它们在细胞内分布的部位，又可分为胞核基因和核外基因。胞核基因存在于细胞核内，位于染色体上；核外基因分散在细胞质内，又称胞质基因(真核细胞的细胞器基因)。 原核生物基因结构特点 大多数原核细胞中，只有一个DNA分子，即一条染色体。原核细胞基因组DNA的绝大部分可编码蛋白质，其中只有极小部分不转录，即非编码区。 在原核细胞中，功能相关的结构基因相互串联排列，受上游共同调控区的控制，同时转录，同时翻译，最终形成功能相关的几种蛋白质。 41-44bp ● 原核生物启动子结构 Pribnow 原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列 Pribnow框或-10区： -4 ~ -13bp之间由６个核苷酸组成，多数是TATAA序列。 -35区：-35bp前后保守的TTGACA序列。 原核生物DNA特点归纳:  ①绝大多数的原核生物DNA分子都会发生转录和翻译。 ②原核生物基因中，编码具有相关功能的RNA或蛋白质的，能串连在一起，集中于基因组的特定部位，共同形成某些功能或转录单元。 ③原核生物基因具有重叠基因。 原核生物mRNA特点: ①半衰期短。