9实验九大豆脲酶提取与动力学研究-袁永泽-2016-04-14.ppt

大豆脲酶制备与动力学研究 生物化学与分子生物学教研室 指导教师：袁永泽 生物技术大实验 一、实验目的 1、掌握脲酶提取的基本方法 2、掌握脲酶活性检测方法 3、掌握脲酶动力学研究的实验原理 作图法求取动力学参数(Km、Vmax) 4、理解底物浓度、pH以及抑制剂对酶Km 的影响、利用作图法判断抑制类型 二、实验原理 1、脲酶（urease）的基本生化性质 ① 脲酶广泛分布于植物种子中，也存在于某些微生物中。 刀豆、大豆、黄豆中含量丰富。 ② 脲酶催化脲的水解反应，专一性高，生成氨与CO2。 ③ 脲酶为寡聚酶， 分子量约为483 KD, 等电点为4.8, 最适pH 7.0。 ④ Km与来源及测定条件 有关，参见表1。 表1 脲酶Km与来源、测定条件的关系 √ 二、实验原理 2、脲酶活性测定原理 脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。 反应式： （NH2)2CO + H2O 2 NH3 + CO2 氨与奈氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度 成正比。故可以测定脲酶活力的大小。反应式： NH3·H2O + 2K2HgI4 + 3KOH → HgO·HgNH2I + 7KI + 3H2O （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 奈氏试剂法试剂昂贵 但较为精确 三、实验器材与试剂 1. 粉碎机、试管、烧杯、离心机(离心管)、分光光度计等。 2. 脲酶提取液（粗酶液），使用时可以磷酸缓冲液适当稀释。 3. 标准脲（尿素）溶液：0.01, 0.02, 0.04, 0.08 mol/L。 3%脲的磷酸盐溶液（5.4%磷酸氢二钠- 4.25%磷酸二氢钾） 4. 磷酸盐缓冲液（PBS, pH7.0）：0.1, 0.4, 0.8 mol/L。 5. Tris-H2SO4缓冲液：50 mmol/L, pH 5, 6, 7, 8, 9。 6. 标准硫酸铵溶液：40 mmol/L（即40 mmol/ml） 7. 奈氏试剂：配制方法参见教材；注意离心取上清，避光储 于棕色瓶中备用。 8. 人造沸石、2%乙酸、32%丙酮 9. 10%（W/V）三氯乙酸（沉淀蛋白、终止酶反应！） √ 1、脲酶的提取 ① 称取5 g人造沸石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡两次，倾 去酸，用蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。 ② 称取10 g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造沸石， 再加入50 ml 32%丙酮溶液，冰浴中持续摇动15-20 min， 4℃、10,000 rpm离心15 min，收集上清液备用。 ③ 向②中沉淀加入10 ml 32%丙酮溶液，重悬，复抽提一 次（操作同上），两次上清合并，即为粗酶液。 四、实验内容与操作步骤 √ √ 2、脲酶活性的测定 试管号 步 骤 1 2 3 （1）酶液（mL，原液或适当稀释） 0 0 1.00 （2）标准硫酸铵溶液（mL） 0 0.30 0 （3）蒸馏水（mL） 2.00 1.70 1.00 （4）10%· 三氯乙酸 (mL) 1.00 1.00 0 （5）室温平衡5 min。 （6）3%尿素（mL） 1.00 1.00 1.00 （7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5 min，立即向样品管（3号管）加10%三氯乙酸 1.00 mL，终止反应。各管摇匀后，取1.0 ml溶液置于EP管中，室温、10,000 rpm离心 5 min，吸取0.2 ml上清按步骤（8）进行反应。 （8）另取3支洁净的试管，分别对应于上述各管，进行后续反应。 ① 反应液（mL） ② 蒸馏水（mL） ③ 奈氏试剂（mL） 0.20 4.30 0.50 0.20 4.30 0.50 0.20 4.30 0.50 （9）各管混匀后30 min内，用分光光度计F1800测试： 比色记录A480nm A1 A2 A3 ● 结果与分析 脲酶活力（U/ml）= 式中：n为酶样品的稀释倍数 请思考下面三个问题，这对保证本实验的完成质量很重要! ① 根据上述计算公式，脲酶活力单位如何定义？ ② 你认为上述实验获得的脲酶活性数据严格吗？如果不够 严格，你认为应如何改进实验? ③ 在测活操作中，是否有因素影响结果的准确度？如有不 利因素，应如何克服？ 3、脲酶动力学研究 ① 底物浓度对脲酶反应速度的影响——Km和Vm的测定 原理：酶的Km和Vm是酶反应动力学重要参数。