食品中动物性成分检验方法－鹿肉制品中含猪肉成分之定量检验101.DOC

食品中動物性成分檢驗方法－鹿肉製品中含豬肉成分之定量檢驗 101年3月9日署授食字第1011900778號公告訂定 1. 適用範圍：本檢驗方法適用於鹿肉製品中含有豬肉成分之定量檢驗。 2. 檢驗方法：檢體經DNA萃取後，以即時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction, real-time PCR）之方法。 2.1. 工作環境：工作平台需寬敞、潔淨、光線良好。檢體前處理、檢體DNA抽取、real-time-PCR試劑配製及real-time-PCR等檢驗過程皆需有區隔空間，避免交叉污染。PCR試劑之配製應於無菌操作台內進行。 2.2. 裝置（註1） 2.2.1. 即時聚合酶鏈反應器：ABI PRISM? 7700 Sequence Detection System、ABI PRISM? 7900 Sequence Detection System、Roche LightCycler?或同級品。 2.2.2. 冷凍乾燥裝置：溫度可達 -40℃以下，真空度可達 133 m Bar以下，供檢體乾燥用。 2.2.3. 振盪型粉碎機：Retsch MM200或同級品。 2.2.4. 真空乾燥裝置：供DNA乾燥用。 2.2.5. 高壓滅菌釜。 2.2.6 . 無菌操作台。 2.2.7. 加熱振盪器：具溫控及振盪功能。 2.2.8. 微量冷凍離心機（Micro refrigerated centrifuge）：可達20000 × g，並具 4℃ 溫控功能。 2.2.9. 離心機：供各式微量離心管離心用。 2.2.10. 分光光度計：具波長260 nm、280 nm。 2.2.11. 冷凍設備：具冷藏及凍結（-20°C）功能。 2.2.12. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 2.2.13. 酸鹼度測定儀（pH meter）。 2.2.14. 水浴裝置：溫差 ± 1℃ 以內者。 2.2.15. 天平：最大稱重量為 2000 g ，靈敏度為 0.1 g ；最大稱重量為 100 g ，靈敏度為1 mg。 註1： 本方法所使用或提及之產品品牌及型號不代表為同類產品中最好者；反之，未使用或未提及之產品品牌及型號亦不代表為同類產品中較差者。 2.3. 試藥 2.3.1. DNA抽取用：乙醇（96-100%）採分子生物分析級試藥；適用於動物DNA抽取之市售套組。 2.3.2. Real-time PCR用（註2） 2.3.2.1. 定量試驗用引子及探針 2.3.2.1.1. 哺乳類、家禽類及魚類（標的基因：12S ribosomal RNA，供作內部對照基因） 引子F：12SF, 5￠- CAAACTgggATTAgATACCCCACT A -3￠ 引子R：12SR, 5￠- ATCgRTTMTAgAACAggCTCCTCTA g -3￠ ????????????????? 探針P： 12SP, 5￠-(FAM)- CACCgCCAAgTCCTTTgRgTTT TARgC - (TAMRA)-3￠ 鹿：PCR增幅產物大小154 bp 豬：PCR增幅產物大小154 bp 2.3.2.1.2. 豬（標的基因：12S ribosomal RNA） 引子F：P 12F , 5￠- ggAACAATAgTAAgCACAATCATAg C -3￠ 引子R：P12R, 5￠- CATAAAAACTTTCgTgTggTggA-3￠ 探針P：P12P, 5￠-(FAM)-CATgTAgAAAATgTAgCCCAT TTCTTTCCA - (TAMRA)-3￠ PCR增幅產物大小 121 bp 註2：1. 合成之引子與探針，拆封後，以無菌去離子水稀釋成適當濃度，分裝後置於-20℃貯存備用，探針需避光保存。探針5￠端採用6-carboxy-fluorescein（FAM）標記，3￠端採用6-carboxytetramethyl-rhodamine（TAMRA）標記。 2. 內部對照基因引子及探針之序列中，R為混合鹼基代碼（A/G），表示同時含A及G；M為混合鹼基代碼（A/C），表示同時含A及C。 2.3.2.2. TaqMan Universal PCR Master Mix（適用於ABI PRISM? 7700及ABI PRISM? 7900） 　　本試劑內含real-time PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等，使用時添加引子、探針及待測檢體DNA。 2.3.2.3. LightCycler? FastStart DNA Master HybProbe（適用於Roche LightCycler? 　　??? 本試劑內含re