富马酸基因工程菌的构建化学工程与技术专业论文.docxVIP

I．’ I．’ 北京化工大学硕上学位论文学位论文数据集 北京化工大学硕上学位论文 学位论文数据集 中图分类号 Q812 学科分类号 180．71 论文编号 e o o}of00 l-1 密 级 1001 0 学位授予单位代码 学位授予单位名称 北京化工大学 作者姓名 吴世根 学 号 2008001171 获学位专业名称 化学工程与技术 获学位专业代码 课题来源 研究方向 基因工程与代谢调控 论文题目 富马酸基因工程菌的构建 富马酸，草酰乙酸，苹果酸，丙酮酸羧化酶，富马酸酶，乳酸脱氢酶， 关键词 质粒pPIC3．5K，保守序列，RT—PCR，毕赤酵母，重组菌，发酵 论文答辩日期 2011．05．23 ·论文类型 应用研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名 职称 工作单位 学科专长 指导教师 王芳 教授 北京化工大学 生物化工 评阅人1 邓利 副教授 北京化工大学 生物化工 中科院微生物 评阕人2 徐家立 研究员 生物化工 所 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答辩委员会主席 谭天伟 教授 北京化工大学 生物化工 答辩委员1 苏海佳 教授 北京化工大学 生物材料 生物化工和化学生物 答辩委员2 罗施中 副教授 北京化工大学 学 答辩委员3 邓利 副教授 北京化工大学 生物化工 答辩委员4 张栩 副教授 北京化工大学 生物化工 答辩委员5 征：一． 论文类型：1．基础研究2．应用研究3．开发研究4．其它 中图分类号在《中国图书资料分类法》查询。 学科分类号在中华人民共和国国家标准(CB／T 13745-9)《学科分类与代码》中 查询。 四． 论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 2 摘要富马酸基因工程菌的构建 摘要 富马酸基因工程菌的构建 摘要 富马酸是一种重要的化工原料和精细化工产品，在医药、化工、 树脂等领域有着非常广泛的应用前景，其生物生产方法已经受到了广 泛的重视，如微生物发酵法。本文以毕赤酵母作为出发菌株，研究考 察米根霉富马酸酶基因、毕赤酵母丙酮酸羧化酶基因在毕赤酵母细胞 中的过表达对富马酸胞质途径的影响，以及敲除副产物乳酸代谢过程 中的关键酶乳酸脱氢酶基因，使得更多碳源流向富马酸胞质途径。 本实验克隆了毕赤酵母(Pichia pastoris GSl 15)中编码丙酮酸羧 化酶的基因(PC)，在毕赤酵母中进行了强化表达，以研究PC基因 在毕赤酵母中的过量表达对TCA还原途径碳源分流及草酰乙酸、L． 苹果酸生产的影响。为此，研究构建了表达载体pPIC3．5K．PC，并转 化了毕赤酵母GSl 15。转化子经过表型鉴定，PCR分析和G418浓度 梯度筛选获得了高拷贝的重组子(pas．01)。甲醇诱导表达后，经 SDS．PAGE分析及PC活性检测，发现酶活提高了3倍，说明PC在 毕赤酵母中获得了成功表达。以pPIC3．5K转化菌为对照，对该重组 子进行了草酰乙酸、苹果酸的发酵研究，结果显示草酰乙酸产量 (177．4 mg．L-1)提高了109．6％，L．苹果酸的产量(127．45 mg．L1)提 高33．7％，菌体生物量提高15．7％，表明PC的过量表达有助于L．苹 果酸、草酰乙酸的积累，并且对菌体的生长有一定的促进作用。 为克隆米根霉细胞中的富马酸酶基因，本实验先后更换了二十对 引物，尝试通过逆转录聚合酶链式反应(RT．PCR)扩增富马酸酶基 l 北京化T大学硕十学位论文因片段，未果。随后根据米根霉富马酸酶基因的保守序列设计引物， 北京化T大学硕十学位论文 因片段，未果。随后根据米根霉富马酸酶基因的保守序列设计引物， 扩增得到250bp长度的保守序列，与模板相比同源性只有76％；说明 目前所使用的这株米根霉3．2686细胞中的富马酸酶基因序列与1959 年以色列学者报导的模板序列具有较大差异，该菌中的fumR是一个 新的基因。 克隆了毕赤酵母中编码乳酸脱氢酶的基因LDH，同时也克隆了 博来霉素抗性基因zeocin，构建了LDH敲除载体pMDl8-T-LDHup ．Zeocin．LDHdown，其中上游同源臂有900bp左右，下游同源臂包含 500bp大小的序列，通过同源重组敲除LDH基因。 关键词：富马酸，草酰乙酸，丙酮酸羧化酶，富马酸酶，乳酸脱氢酶 ll ABSTRACTPRoDUCTIoN ABSTRACT PRoDUCTIoN oF FUMAIUC ACID BY RECoMBINANT