sp18族精子膜蛋白基因的克隆及其介导精子亲和捕捉外源dna的初步分析生理学专业论文.docxVIP

中国农业大学博士学位论文 中国农业大学博士学位论文 2002 柏家林 ————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一 spl8族精子膜蛋自基因的克隆及其介导精子亲和捕捉 外源DNA的初步研究 博士生：柏家林 导师：陈永福教授 {中国农业大学生物学院、农业生物技术国家重点实验室北京 100094l 中文摘要： 研究证明哺乳动物受精过程中的精目日识别、结合和融合等事件中精子表面的质膜蛋白 都在发挥重要作用。因此，精子膜蛋白的研究已经成为生殖生理、生殖免疫、免疫不育、 免疫避孕以及利用精子作为载体生产转基因动物的重要领域。 M、鼠、家兔和牛精子表面抗spl8 mAb和抗spl8 IgG的间接免疫荧光定位和 wes惋rnblot研究证明spl8族膜蛋白是一族由14kD、16kD和18kD三种成份组成的 蛋白质家族，位于精子头后部质膜表面。IVF中spl8mAb呈剂量依赖性地抑制小鼠、家 兔和牛精子的受精能力。受精完成后，spl8蛋白未被降解，反而扩散到受精卵质膜中， 继续参与附植前胚胎的早期发育并延续至囊胚阶段。 1、为深入研究spl8族精子膜蛋白的结构和功能及其潜在的应用价值，利用 spl8mAb筛选小鼠睾丸lgtllcDNA表达文库，得到三个阳性克隆，经反复鉴定选择其中 免疫反应最强的一个阳性克隆，命名为spl8。测得spl8 cDNA长1 468bp，开放阅读 框(open reading frame，ORF)约429bp，编码I 42个氨基酸。起始密码ATG位于 第694bp，终止密码位于第l 122bp。spl8cDNA的绝大部分序列10—65lbp与人Hr44 的532—1 173bp、spl8cDNA的10—816bp、864—1444bp与牛Hr44的1408—2208bp、 2250—2309bp cDNA序列有很高的同源性，高达98％。spl8 cDNA编码氨基酸多肽的 理论分子量为15．7kD，有8个潜在的N一糖基化位点和12个潜在的O一糖基化位点，亲 水性分析表明spl8多肽是一种精予跨膜蛋白。根据GeneBank和Swiss序列库分析推 测，spl8基因可能是生殖系统存在的一种新基因，spl8 cDNA基因的GeneBank登录 号(accession number)为AFl29872。 2、用上游引物P3(带有EcoRI位点)和下游引物P。(带有HindIll位点)经PCR 扩增约O．5kb的spl8cDNA基因的编码区，将其亚克隆到原核表达载体 pET一30a(+)／EcoRI+HindIII位点，构建了原核表达载体pET一30a(+)一spl8，并在大肠 spl8族精子膜蛋白基因的克隆及其介导精子亲和捕捉外源DNA的初步研究杆菌BL2I(DE3)中得到诱导表达，表达产物的表观分子量约为16．5kD，表达量约占 spl8族精子膜蛋白基因的克隆及其介导精子亲和捕捉外源DNA的初步研究 杆菌BL2I(DE3)中得到诱导表达，表达产物的表观分子量约为16．5kD，表达量约占 菌体总蛋白的32％。重组spl8诱导表达产物与spl8mAb的western blot分析表明 spl8mAb能识别重组的spl8膜蛋白，表达的重组蛋白具有免疫原性，为进一步研究 spl8蛋白的功能打下了基础。 3、应用PCR扩增spl8 cDNA上约537bp片段作探针，对昆明白小鼠睾丸、附睾、 大脑、肝、肾、肌肉和卵巢等7种组织中spl8精子膜蛋白所编码的mRNA的组织特异 性表达进行了研究。7种组织总RNA的Northernblot表明，spl8精子膜蛋白所编码的 mRNA仅在睾丸和附睾中表达，其大小约为2．0kb。 4、用纯化的重组spl8蛋白作抗原制作了抗家兔多抗(spl8 IgG)，spl8mAb和 spl8IgG在小鼠精子表面的间接免疫荧光定位研究表明，spl8精子膜蛋自主要分布在精 子头后部，在精子尾部前段也有该种蛋白的分布。初步证明，spl8蛋白是精子头后部和 尾部前段比较广泛存在的一种膜蛋白。spl8 IgG可引起牛和小鼠精子头并头的凝集作曝， 表明spl8蛋白与精子的运动能力密切相关。 5、应用我室克隆的牛精蛋白基因PGEM—T—bpro质粒，用引物P5(带有BamH I酶 切位点)和P6(带有EcoR I酶切位点)可扩增正常的牛精蛋白基因bpro。设计一条引物 P7(同样带有EcoR I酶切位点)，将bpro基因终止密码TAA突变为CAG，由引物Ps 和P，可扩增出约168bp的用于构建融合基因的牛精蛋白基因mbpro。将mbpro基因亚 克隆至原核表达载体pET一30a(+)一spl8／EcoR l+Bam