使用在线固相萃取和柱间衍生直接分析血浆中的雌性激素雌激素是一.PDFVIP

PromoChrom Technologies – 直接分析血浆中的雌性激素 使用在线固相萃取和柱间衍生直接分析血浆中的雌性激素 PromoChrom Technologies Ltd. 雌激素是一类甾体化合, 主要有雌酮 (estrone, E1), 雌二醇 (estradiol, E2), 和雌三醇 (estriol, E3)等。雌激素的分析对于疾病的诊断具有重要的意义。 雌激素的分析通常是使用 HPLC 或 LC-MS。由于检测的浓度比较低, 而紫外和质谱 检测器对这类化合物的灵敏度又不是很理想, 在分析前通常需要衍生化。衍生化通 常是在手动的条件下进行。反应的加热时间, 放置时间, 和试剂用量的差异都会影 响分析结果的重复性. 此外, 衍生化试剂是直接加入到未经净化的样品中, 样品成 分的变化也会影响衍生反应的进行。 本文以雌酮为例, 介绍一种血浆中雌性激素的直接分析方法。样品经在线固相萃取 净化和在线衍生后直接用 HPLC 分析, 样品制备和仪器分析全部自动完成。 材料和方法 仪器 仪器包括一台 SPE-04 多功能样品制备仪和安捷伦 1100 液相色谱仪 (含四元泵和紫外检测 器) 。两套仪器通过遥控信号实现同步。 - 1 - PromoChrom Technologies – 直接分析血浆中的雌性激素 方法 下面两张图描述 SPE-04 的自动运行步骤和有关的衍生化反应: 所用固相萃柱为 PromSil C18, 规格为 500-mg/3-mL. SPE-04 可以使用普通的固相萃 柱, 不需要使用特别的接头或盖子。 HPLC 条件: 色谱柱, PCTsil-C18 (4.6X250 毫米); 流速, 1.2 毫升/分钟; 淋洗梯度, A 为 乙氰, B 为 0.1%三氟醋酸, 开始为 30%A, 8 分钟内 A 增加到 90%,维持 4 分钟后 A 又 降回潮 0%; 检测波长, 360 纳米; 进样体积, 20 微升。 雌酮衍生物在此条件下的保留 时间为 12.0 分钟。 结果 1. 灵敏度 血浆样品分别添加 2 和 20PPM 雌酮, 用水稀释一倍,然后用上述方法分析。由下图 可见, 所用的在线 SPE 净化可以有效去除样品的干扰。衍生后可以使用较长的检测 波长, 也有助于降低基线噪音。根据下图估算, 雌酮在血浆样品中的最低检测浓度在 0.5PPM以下。要进一步提高灵敏度, 可以使用荧光或质谱检测器。 - 2 - PromoChrom Technologies – 直接分析血浆中的雌性激素 上图：添加 20 ppm 雌酮的血浆样品 下图：添加 2 ppm 雌酮的血浆样品 2. 重现性 水中添加 20 ppm 雌酮后重复分析四次。所得结果见下表: 重复 峰面积(s.mAU) 1 131.6 2 135.3 3 138.0 4 133.9 平均