单分子酶学研究进展-分析化学.PDFVIP

第44卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 评述与进展 第9期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2016年9月 ChineseJournal of Analytical Chemistry 1437~1446 藡蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥藡蕥蕥 DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.160201 评述与进展 藡蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥 藡 单分子酶学研究进展 徐 艳摇 孙乐乐摇 高延静摇 秦为为摇 彭天欢摇 李 迪* (中国科学院上海应用物理研究所,物理生物实验室,上海光源国家科学中心(筹)生物成像中心,上海201800) 摘摇 要摇 源于20世纪90年代的单分子显微成像技术成功实现了对单分子酶的催化过程实时监控,此后单分 子酶学的研究进入了快速的发展时期,发现了多种酶的新单分子行为及反应机制。 单分子酶学的研究能够发 现隐藏于整体平均水平下的单个酶分子的个体行为,揭示了酶与底物作用的动态变化,加深了人们对各种生 化反应的理解。 关键词摇 单分子;酶;核酸酶;荧光共振能量转移;荧光显微镜;综述 1摇 引摇 言 酶能够催化多种生理生化反应,是维持机体正常运转不可或缺的重要因素。 尽管对酶的研究由来 已久,但是人们一直持有疑问:酶在催化时如何动态变化? 同种酶的不同个体之间是否存有差异? 酶与 底物如何相互作用? 采用传统的测定方法很难回答这些问题,因为传统方法只能测定溶液中无数个酶 分子的平均值,是一个共性的表达,故而不能够反映单个酶分子的个性。 20世纪90 年代,科研人员开 始尝试在室温条件下进行单分子成像等技术的研究[1~7] ,此后不断发展完善的监测方法、成像技术以及 单分子操纵手段等最终为室温条件下在单分子尺度上探索酶的功能提供了条件。 基于荧光显微镜的单 分子酶学研究可观测到单个酶在催化时的动态波动,因而可以从更深层次上挖掘酶的功能信息。 近年 来的单分子酶学的研究证实了在催化过程中酶自身结构是动态变化的。 这就提出了一个新的问题,为 什么酶结构会波动变化? 众所周知,酶是由氨基酸链构成的,而氨基酸链必须折叠成特定的构象才能够 [8] 发挥酶的正常功能。 然而在热运动情况下,酶为了维持特定的构象就必定会造成氨基酸链的波动 , 而氨基酸链的波动也必定诱导酶的构象在一定程度上发生波动变化。 这就解释了为什么酶会有不同的 构象,并且每种构象都具有特定的活性。 同时,酶的能级相图(Energy landscape)决定了酶热力学和动 力学上可达到构象的个数、不同构象之间的比例以及构象之间相互转换的速率,酶可能在同一构象中翻 转多次后才会向着在催化活性较低的构象改变,这就是酶在催化过程中产生记忆效应的原因。 利用荧光显微镜在单分子尺度上对某种酶的催化反应进行监测已成为一个重要的研究方向。 通用 的策略是首先通过某种方式将酶分子疏松地固定在界面上,然后加入反应溶液,利用荧光显微镜实时记 录酶催化过程中所产生的某种荧光信号的变化,最后提取单个酶催化的荧光强度随时间变化的轨迹并 进行数学分析,得出酶催化时的动态过程。 采用此方法研究酶的催化时需要长时间测定荧光状态的变 化,由于受到测定方法的限制,因而选择研究体系时可从以下几方面入手:(1)酶自身荧光活性状态在 催化过程中能够发生改变;(2)酶可以催化无荧光的底物生成荧光产物;(3)底物易于标记荧光,酶在催 化底物后生成荧光状态不同的产物;(4)酶自身或酶与底物标定 FRET对,研究酶与底物的相互作用; (5)酶在催化反应前后受构象影响导致荧光强度变化巨大。 单分子荧光显微镜可同时独立记录多个酶 分子催化过程中荧光信号变化,通过统计学分析建立数学模型,可以得到单个酶分子在催化过程中的动 态波动,为人们深入理解某个特定的催化体系提供具有统计学意义的理论支持。 本文对蛋白质酶以及 核酸酶的单分子研究进展进行了简单概述,以期加深读者对单分子酶学领域的理解。 摇 2016鄄03鄄