用质粒DNA或双链RNA显微注射C线虫.PDF

用质粒DNA 或双链RNA 显微注射C. 线虫 三十多年前 Sydney Brenner 建立了C. 线虫动物模型，显 微注射C. 线虫主要的应用集中在制备转基因线虫和用RNA 干扰技术来进行基因敲除。我们在此阐述了在我们实验室 中基于该目的而建立的显微注射技术。 显微注射 C. 线虫应用 ● 注射DNA 制备转基因线虫 ● 注射dsRNA 或RNAi ● 注射蛋白 应用领域 转基因动物可以做许多工作，其中一些如下： ● 用携克隆DNA 的细菌显微注射直接制备转化突变系 ● 表达模式分析（如GFP 融合构建） ● 结构/ 功能分析 ● 启动子研究 ● 通过外源基因或基因型表达/ 异常表达来进行表型分析 表1：显微注射线虫应用 ● 倒置显微镜 制备琼脂糖板 ● 显微操纵仪TransferMan NK2 将 2% 60℃的琼脂糖倒在盖板片的中央，小心地在上面放 ● 显微注射仪FemtoJet express 上另一块盖玻片，这样凝胶会变得非常薄，小心气泡产生， ● 拉针仪 凝胶最好大一些以便于操作更多的线虫，取出其中一块盖玻 ● 真空干燥仪 片，在空气中干燥过夜，第二天使用前将凝胶放置在真空干 ● 注射针 燥仪中 2~4 小时，干燥凝胶非常重要，否则线虫不能粘在 板上，凝胶板贮存在密封箱中，最好在干燥仪中。 制备注射针并加入注射混合物 ● 琼脂糖 用机械拉针仪来制备注射针，拉针参数（热，力，速度，时间） ● 矿物油 可以通过实验获得，虽然每一用户都可以获得自已独特的参 ● 玻璃显微注射管；100 mm 长，1.2 mm 外径 数，但好的针管尖端都迅速收缩并形成开放尖口，依靠加热 ● 盖玻片；48 mm ×60 mm，1 mm 厚 丝的位置可以获得不同口径的尖端。如果尖端闭合，针尖就 ● 微量加样针20 µl 不得不被撞断来进行注射。通过注射针的尾端，用又细又长 的加样针将注射混合物装入注射针中。 22 No. 9 装针并断针 FemtoJet express 提供了一种 “ 自动” 和一种 “手动” 的注 将显微注射针装在显微操纵臂上，持针器连在 FemtoJet 射方式，注射动作由手控或可选脚踏板激发，“ 自动” 方式 express （注射仪）上， FemtoJet express 连着压缩氮气瓶， 的注射时间是可以设定的，而 “手动” 方式的注射时间是单 将一玻璃管放在盖玻片上并用矿物油完全覆盖，将这一盖玻 独设定的，就是说注射时间由手控或脚踏板控制，在我们实 片放置在蔡司 Axiovert 135 倒置显微镜上，调整玻璃管使