生物化学技术原理及应用 (2).pptVIP

* 由于密度梯度本身具有很好的抗对流、抗扰动作用，因此可以减轻在操作过程中的一些机械扰动及在离心过程中的一些干扰因素，如温度变化的影响等，以提高分离的效果。其次，还可以起到稳定样品和样品层的作用。颗粒在密度梯度中具有一定的区带宽度，区带前沿受到的离心力大，因此，颗粒倾向于区带前沿扩宽，但是由于前沿的颗粒同时又遇到了具有更大粘度和密度梯度液的阻力，倾向于前沿方向扩宽的颗粒的扩宽速度又会变慢。在离心力和密度梯度的反作用力趋向平衡的时间，区带维持一个稳定状态。这种稳定状态的维持主要取决于密度梯度的形状和密度梯度物质的性质。在密度梯度离心中，由于梯度的存在，沉淀的样品会被压实，对离心样品的结构和形状起到了保护作用。 * * * * * * * * * * 第二节 离心机的构造与类型 水平转头 转头静止时,处在转头中的离心管中心线与旋转轴平行。 转头旋转加速时,离心管中心线由行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋转轴成90 °角。 粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本一致，有少量的“管壁效应” 。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 水平转头 转头水平转头的特点： 转头的重心位置较高 样品粒子沉降穿过溶剂层的 距离大于直径 对多成分样品分离特别有效 常用于速率区带离心和等密度离心 优点是有利于离心后由管内分层取出已分离的各样品带。 缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第二节 离心机的构造与类型 垂直转头： 离心管垂直放置，样品颗粒沉降距离最短，离心所需时间短。适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作90°转向，因而降速要慢。 离心管垂直插入转头孔内，在离心过程中始终与旋转轴平行，而离心时液层发生角的变化，从开始的水平方向改成垂直方向，当转头降速时，垂直分布的液层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成水平方向。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第二节 离心机的构造与类型 区带转头： 区带转头无离心管，主要由一个转头桶和可旋开顶盖组成。 转头桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转头四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 区带转头： 区带转头特点： 沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头，在径向的散射离心力作用下，颗粒的沉降距离不变，因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好 转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。 缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第二节 离心机的构造与类型 连续流转头： 用于连续流离心，可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转头桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转头桶壁，上清液由出口流出。 适用于稀溶液、大体积样液离心，可减少开机时间，提高效率。 也适用于在发酵工业化规模生产的细胞和培养液的分离，及不同生长周期细胞的分离。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第二节 离心机的构造与类型 离心管 主要用塑料，不锈钢和特种玻璃 塑料离心管： 优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。 缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用： 防止样品外泄。 防止样品挥发。 支持离心管，防止离心管变形。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第三节 离心的基本方法 离心分离是制备生物样品广泛应用的重要手段。如分离活体生物、细胞器、生物大分子、小分子聚合物等。 对于生物样品的离心分离方法，主要是根据样品的不同来源和不同性质采取不同的离心方法。 目前常用离心方法有： 沉淀离心 差速离心 连续流离心等 其它方法 连续流离心原理见连续流转头介绍 * 南京农业大学 生命科学学院 * 密度区带离心 速率区带离心 等密度区带离心 第三节 离心的基本方法 1. 沉淀离心 沉淀离心技术是目前应用最广的一种离心方法。一般是指选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称为沉降离心。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 根据颗粒大小来确定沉降所需要的离心力。 主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料，及病毒和染色体DNA等的离心分离。 沉降速度与离心力和颗粒大小有关，如右图： 第