以EV713C为靶标的抗病毒药物筛选模型的建立及抗3C化合物筛选.PDFVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2017, 44(9): 776~782 EV71 3Cpro 为靶标的抗病毒药物筛选 模型的建立及抗3Cpro 化合物筛选* 1) 1) 1) 2) 2) 1)** 施暖 李倩雯 潘 婷 孟小斌 黄清苑 郭学敏 1) 2) ( 中山大学 山医学院人类病毒学研究所，广州510080； 梅州市人民医院，梅州514031) 摘要 建立一种以EV71 3C 蛋白酶为靶标的抗肠病毒药物筛选模型，并应用于小分子化合物库筛选具有抗EV71 活性的化合 物 从临床手足口病例标本 分离肠道病毒进行PCR 鉴定及基因组测序 通过插入突变在黄色荧光YFP 编码框合适位点处 引入EV71 3C 酶切位点，构建对3C 蛋白酶敏感的报告质粒pcDNA3-mYFP ，然后将其与表达3C 的质粒共转293A 细胞，在 3C 抑制剂Rupintrivir 存在与否的情况下通过荧光显微镜和酶标仪检测 (500nm)/ (535nm)荧光信号的变化，判断建模是否 Ex Em 成功；利用建好的筛选模型在高通量药物筛选平台对小分子化合物库进行初筛和复筛；再利用空斑分析检测筛选出的活性化 合物是否对临床分离的EV71 毒株具有抑制作用 mYFP 在293A 细胞 表达良好，3C 的表达使荧光信号下降 80% ， Rupintrivir 的存在则几乎不影响荧光表达，说明以3C 为靶位的筛选模型构建成功 经过高通量初筛和复筛从26 000 多种小 分子化合物 获得26 种能够显著回复mYFP 表达的活性化合物；空斑分析显示其 2 种化合物具有较为明显的抑制EV71 复制的活性 因此，我们所构建的3C-mYFP 共表达系统是一种简便有效的、可用于高通量筛选抗EV71 3Cpro 药物的筛选 模型 关键词 手足口病，肠道病毒71 型，3C 蛋白酶，高通量筛选，抗病毒药物 学科分类号 R373.2，R9 DOI: 10.16476/j.pibb .20 17.0167 手足口病(hand foot and mouth diseases, HFMD) 有药物资源寻找新型靶向药的最有效的方法之一 是全球性传染疾病，尤其在亚太地区广泛流行[1] 本文通过在报告基因YFP 插入3Cpro 敏感酶切位 近年来，手足口病发病率、重症和死亡病例数居于 点合并共转染分析，以报告基因YFP 的荧光强度 国丙类传染病之首 引发HFMD 的肠道病毒有 作为观察指标，建立了一个以EV7 1 3C 蛋白酶抑 20 多种(型) ，其中以柯萨奇病毒A 16 型(CVA 16)和 制药为靶标的筛选模型，并将该模型应用于一个包 肠道病毒71 型(EV7 1)最为常见[2-3] 全球首个保护 含2 万种小分子的化合物库，在高通量药物筛选平 性EV71 灭活疫苗于2015 年底在 国上市，该疫 台进行了初筛、复筛，最后利用临床分离的EV71 苗为C4a 单价疫苗，对不同基因型的EV71 毒株感 毒株对筛选出来的活性化合物进行了抗病毒活性的 染均有一定的保护作用，但无治疗作用 目前对于 人工复证 已经感染EV71 或其他肠道病毒的HFMD 患者而 1 实验材料与方法 言，缺少有效的抗病毒药物，主要采取对症和支持 疗法 因而急需开发特异性抗肠病毒药物