基于DNA条形码的细小种子类及含靛玉红类中药材的鉴定研究-中药学专业论文.docxVIP

I I 中文摘要 我国药用动植物资源丰富，2010 年版《中国药典》收录的中药多达 600 多种。然而由于南北差异和历史沿革等原因，同名异物的混淆品或代 用品极多，严重影响了中药材的临床疗效和用药安全，一直是中药产业化、 国际化的主要挑战之一。DNA 条形码技术在解决这一问题上拥有自己独 特的优势，2010 年版《中国药典》增补本已收录中药材 DNA 条形码分子 鉴定指导原则。本文以《中国药典》收录的直径小于 2 毫米的细小种子类 中药材和含靛玉红类中药材为研究对象，基于 ITS2 序列探讨中药材 DNA 条形码分子鉴定法在实际鉴定工作中的操作流程及实际应用价值，得出以 下结论： （1）本实验以直径小于 2 毫米的车前子、青葙子、天仙子、葶苈子、 菟丝子和王不留行 6 种细小种子类中药材及其混伪品为研究对象，共包含 28 个物种 144 份实验材料。用试剂盒法提取细小种子类中药材及其混伪 品的 144 份样本的总 DNA，通过 PCR 扩增其 ITS2 序列并双向测序。应 用 CodonCode Aligner v 4.25 对测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列 及引物区获得 ITS2 序列。用 MEGA 6.0 软件计算物种种内和种间的 K2P 遗传距离，分析变异位点并构建邻接（NJ）系统聚类树。综合应用相似 性搜索法、最近距离法以及 NJ 系统发育树等进行鉴定分析。结果显示， 144 份样本的 ITS2 序列的扩增效率和测序成功率均为 100%，6 种中药材 9 个基原物种的 ITS2 序列长度范围为 194~221 bp。基于相似性搜索法， ITS2 序列鉴定效率为 88.9%。基于 K2P 模型计算遗传距离，平车前、车 前、青葙、天仙子、独行菜、播娘蒿、菟丝子、南方菟丝子、麦蓝菜 9 个物种的最大种内遗传距离分别为 0.005、0、0.009、0.005、0.010、0.021、 0.005、0.034、0，小于 9 个物种的最小种间遗传距离 0.047；平车前、车 前、独行菜、播娘蒿、菟丝子、南方菟丝子和天仙子的最大种内遗传距离 小于其与其混伪品的最小种间遗传距离；青葙的最大种内遗传距离等于其 与其混伪品的最小种间遗传距离。NJ 树图结果显示，除平车前和青葙外， II II 其余的 7 个物种均能各自聚为一支，表现出良好的单系性，与混伪品明显 的区分开。虽然基于 NJ 树图法，ITS2 序列不能很好的区分平车前及其伪 品大车前，但相似性搜索法和最近距离法的结果均证明 ITS2 序列能够鉴 别平车前及其混伪品。因此，ITS2 序列能够准确鉴别除青葙子以外的 5 种细小种子类中药材，为保障临床用药安全提供了有效的技术手段。 （2）本实验共收集 57 份菘蓝、蓼蓝、马蓝及其混伪品的样本。随机挑 选 24 份菘蓝、蓼蓝、马蓝及其混伪品样本，并对其 matK、rbcL、psbA-trnH 和 ITS2 序列进行 PCR 扩增和测序，比较各序列扩增成功率、测序成功率、 鉴定能力，结果显示 ITS2 序列是最理想的 DNA 条形码；PCR 扩增和测 序剩余的 33 份样品的 ITS2 序列，分析其种内、种间遗传距离，构建 NJ 系统聚类树。最小距离法及 NJ 系统聚类树图均表明 ITS2 序列能准确鉴 别菘蓝、蓼蓝、马蓝及其混伪品。另外，本研究应用高效液相色谱法检测 菘蓝、蓼蓝、马蓝及其混伪品大青、木蓝、水蓼、火炭母、球花马蓝以及 中药材青黛等 31 份样本中是否含有靛玉红成分。结果显示仅在中药材青 黛和药用植物菘蓝、蓼蓝、马蓝的叶片中检测到靛玉红成分。 综上所述，DNA 条形码分子鉴定法能够准确鉴定车前子、天仙子、 葶苈子、菟丝子和王不留行 5 种细小种子类中药材；DNA 条形码技术与 高效液相色谱法相结合能够实现对含靛玉红类中药材及其混伪品的有效 鉴定，为其它重要中药材的鉴定研究提供了新思路和新方法。 关键词：ITS2；DNA 条形码；细小种子类中药材；含靛玉红类中药 材；高效液相色谱法； PAGE PAGE VI Identification of Tiny Seed and Indirubin Containing Chinese Medicinal Materials by DNA Barcoding Specialty：Chinese Traditional Medicine Author：TU Yuan Tutor：ZHANG Xiu-qiao Abstract China has abundant medicinal plant and animal resources. More than 600 kinds of traditional Chinese medicine have been liste