基于DNA催化颈环自组装致病菌检测新方法研究-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

重庆医科 重庆医科大学硕士研究生学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名词对照 英文缩写 英文全称 中文全称 CHA catalyzed hairpin assembly 催化颈环自组装 ABTS2- 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfo nic acid) 2,2′-连氮基-双-(3-乙 基并二氢噻唑啉-6-磺酸) Hemin hemin 氯化高铁血红素 PBS Phosphate buffer solution 磷酸盐缓冲液 ELISA Enzyme-linked immunosorbant assay 酶联免疫吸附试验 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 C+Y C+Y synthetic medium C+Y 半合成培养基 LB Lysogeny broth LB 培养基 PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 OD Optical density 光密度值 HCR Hybrid chain reaction 杂交链反应 DNA Deoxynucleic acid 脱氧核糖核酸 RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 1 基于 DNA 催化颈环自组装的致病菌检测新方法研究 摘 要 近年来，细菌感染成为一个全社会共同关注的严峻问题。尤其是 抗生素广泛甚至不合理使用，导致耐药性相当严重。超级细菌的产生 已引起医学界广泛关注。另外，在细菌感染的诊断、监测以及医院感 染的流行病学调查、消毒灭菌效果的评价等方面，临床微生物学检验 也具有特别重要的作用。因此，建立一种通用、简单、快速、价廉、 灵敏、特异的对病原菌检测方法显得极其重要。本研究主要包括以下 两个部分： 1. 基于 DNA 催化颈环自组装高灵敏检测肺炎链球菌的比色传感研究 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）是一种常见的致病 菌，可以引起一系列感染性疾病，如社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜 炎和菌血症等。本研究以肺炎链球菌 lytA 基因的部分序列为靶物质， 结合一个 DNA 信号转换器和颈环自组装（catalyzed hairpin assembly， CHA）信号放大策略，构建 DNAzyme 比色传感器对其进行高灵敏度 的检测。将靶物质 DNA 与一个转换器颈环 DNA 相结合，形成新的核 酸序列并打开颈环，暴露出颈环干封住的核酸序列，以此触发 CHA 循 环放大反应。催化颈环自组装反应后，产物含有大量自由的并且富含 鸟嘌呤 G 的核酸链。当氯化高铁血红素存在的情况下，可与富含鸟嘌 2 呤的核酸链结合形成 G-四联体复合物，即 DNAzyme。DNAzyme 具有 类辣根过氧化物酶活性,在 H2O2 存在的情况下，能够催化底物 2,2′- 连氮基-双-(3-乙基并二氢噻唑啉-6-磺酸)二价阴离子(ABTS2-)氧化成 蓝绿色物质 ABTS-。在最优条件下，50 pM-200 nM 的浓度范围内吸光 度值与合成靶序列的浓度对数成线性关系，最低检测限是 32 pM。该 方法不仅成功地用于检测 PBS 缓冲液中 S.pn，其最低检测线为 156 CFU mL-1，还应用于检测临床样本中的 S.pn，并可通过肉眼分析结果。另 外，该方法在近缘种链球菌和其他主要致病菌中展示了很好的特异性。 因此该传感器将能够为临床病原微生物诊断提供有力的工具。 2. 基于核酸适体的通用型比色传感器直接检测鼠伤寒沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌属革兰阴性肠杆菌，是引起急性胃肠炎的主要病 原菌之一。目前致病菌的检测方法主要有：传统的细菌培养鉴定、酶 联免疫吸附法（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）技术。但这些方法 费时、费力、成本高、需要专业人员及较高实验条件等。因此，现场、 快速、灵敏、准确的检测和鉴定致病菌极为重要。 本实验建立了一种基于核酸适体特异性识别靶细菌，利用 CHA 模 板进行信号循环放大的通用型比色传感器，可对各种细菌进行高灵敏 检测。当鼠伤寒沙门氏菌存在时，与特异性核酸适体结合释放出 CHA 模板触发序列，催化颈环自组装，暴露 G-四联体与氯化高铁血红素结 合，催化 ABTS2-和 H2O2 产生颜色变化，根据颜色变化程度对靶细菌进 行定量分析。将该检测技术应用于 PBS 缓冲液中鼠伤寒沙门氏菌的检 测，最低检测线可到 103 CFU mL-1，用时仅 2 小时。同时，该方法仅 3 仅通过改变转换器的序列，实现对不同的靶物质核酸和细菌的间接或 直接检测,展示了其通用性。所建立的简单、通用的新方法已成功用于 沙门氏菌的