基于DNA扩增技术利用糖代谢标记检测细胞表面糖苷-应用化学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 基于 DNA 滚环扩增技术利用糖代谢标记检测细胞表面糖苷 摘要 滚环扩增（RCA）技术是一种等温扩增技术，是在酶促作用下合成一条具有 多个重复序列的长的单链 DNA。用化学信标（如炔基或叠氮基）代谢标记聚糖 可以把化学基团标记在细胞中的糖缀合物上，代谢标记技术与生物正交化学相结 合是一种有力的糖成像工具。目前，代谢标记技术已被用于细胞表面糖和糖蛋白 的成像。本课题研制了一种基于代谢标记和 RCA 技术对细胞表面标记的聚糖成 像的方法。 首先，RCA 被用于检测细胞表面代谢标记的叠氮糖。这种方法的优点是它 避免了引入过多的干预细胞正常生理功能的非自然糖。本实验所用最优叠氮糖浓 度是 5.0 μM。由于荧光强度的增加，因而可通过酶标仪方便地检测细胞自身生 物合成的糖。结果表明，代谢标记的能力对于不同的糖和不同的细胞都是不同的。 这一现象说明叠氮糖参与聚糖生物合成过程并不是随机的，聚糖的类型由细胞的 种类确定。因此，利用这种方法可以对生理过程中不同阶段糖含量的变化进行追 踪。 其次，RCA 被用于对细胞表面代谢标记的糖成像。结果表明，滚环扩增技 术对代谢标记的放大效果显著，可以在低浓度叠氮糖的作用下得到清晰的荧光成 像图。 最后，RCA 技术与荧光能量共振转移（FRET）技术相结合应用到细胞表面 特异性蛋白聚糖的成像中。通过与 FRET 技术相结合，使用特异性的蛋白质和适 当的叠氮糖可以实现对特定糖缀合物的检测。这种方法广泛适用于细胞蛋白糖基 化的成像，可以对特异性蛋白上的特定糖型进行检测。 本实验主要是把 RCA 技术应用在糖代谢标记中，利用这种方法可以监测细 胞糖基化的状态和研究糖基化对细胞功能的调节，为由蛋白糖基化异常引起的疾 病的早期诊断和治疗提供科学的指导。 关键词：滚环扩增技术；代谢标记；激光扫描共聚焦显微镜；荧光能量共振转 移；Gpc3 蛋白 I Applying DNA Rolling Circle Amplification in Fluorescence Imaging of Cell Surface Glycans Labeled by Metabolic Method ABSTRACT Rolling circle amplification (RCA), an isothermal DNA replication technique, is a process for the enzymatic synthesis of long ssDNA with many repeating sequences. Metabolic labeling of glycans with chemical reporters (such as alkyne or azide) can incorporate chemical groups into growing cells’ glycoconjugates, in conjunction with bioorthogonal chemistry, is a powerful tool for imaging glycome. Currently, metabolic labeling technology has been used for imaging cell surface glycan and glycoprotein. Here we report the development of a metabolic labeling- and RCA-based methodology that allows glycans imaging on cell surface. First, RCA was used for testing the cell surface glycans labeled by azido sugars. The advantage of this method is that it avoids introducing too much unnatural sugar, which can interfere with normal, physiological cell function. The optimum concentration of azide sugar used in this experiment was 5.0 μM. Simultaneously, the enhanced fluorescence intensity conveniently facilitates the detection of cells’ own biosynthetic glycans by simply