基于DNA条形码及实时荧光定量PCR技术的燕窝鉴别研究-中药学专业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 Boostrap(1000次重复)检验各分支的支持率；最终建立燕窝商品基原物种的Cytb、ND2、COI、12S Boostrap(1000次重复)检验各分支的支持率；最终建立燕窝商品基原物种的Cytb、 ND2、COI、12S rRNA条形码序列。 3． 根据序列分析找出在金丝燕属中保守却在其他物种中有差异的区域设计特异靶 向金丝燕属物种的引物和TaqMan探针，蛋白酶K法提取燕窝线粒体DNA，采用实 时荧光定量PCR技术对燕窝样品进行检测，以提取纯化后的正品燕窝基因组DNA为 阳性标准品并稀释至不同倍数，以标准品模板拷贝数的对数作为横坐标，以实时荧光 定量PCR的CT值为纵坐标，绘制标准曲线；以人、鼠、鸡、猪、鱼、海带等的线粒 体DNA为阴性对照检测其特异性；对不同浓度的燕窝DNA模板进行检测考察其敏感 性；对三个浓度的阳性标准品分别作5次重复检测以考察该方法的重复性和稳定性。 4． 由于市场上多有将猪皮全部或部分掺入燕窝中的造假现象，为了有效鉴别出燕窝 样品是否含有猪皮成分，借鉴食品方面检测掺假的方法，本实验分别选用猪的通用引 物扩增其部分DNA序列，把猪皮分别按50％，30％，10％，5％，l％的比例掺入正品 燕窝中，提取总DNA，进行PCR，电泳检测PCR产物并测序鉴定物种，以建立一种 快速检测燕窝中猪源成分的PCR方法。 结果： 1． 将所得样品序列拼接校正后经MEGA软件对齐删减，最终选取所有样品长度均 为290bp的一段峰形规则的Cytb序列。BLAST搜索结果显示各个样品相似性最高的 前几十条序列均为雨燕科金丝燕属Aerodramus的物种，与其最相似序列的相似度均 为100％。290bp的Cytb基因序列中，保守位点270个，保守位点占核苷酸总数的93．1％， 变异位点20个，变异位点约占核苷酸总数的6．9％。K一2p遗传距离计算结果显示所 有样品之间的遗传距离在0．000．0．062之间，从各样品序列的遗传距离和简约信息位点 来分析，32个样品中将有三个基原物种的差异。NJ系统发育树结果显示，23个样品 均与所有的爪哇金丝燕Aerodramusfuciphagus聚为一支，支持率为84％，确定其生物 来源为爪哇金丝燕；8个样品与所有的淡腰金丝燕Aerodramusfuciphagusgermani聚 为一支，支持率为74％，确定其生物来源为淡腰金丝燕；32号样品与所有的大金丝燕 Aerodramus maximus聚为一支，支持率为96％，但由于Genbank上所查询的大金丝燕 A，maximus和其亚种A．maximus lowi并未产生分支，因此认为该样品的生物来源为大 金丝燕A．maximus或其亚种A．maxflnUS lowi。 2． 最终获得样品长度为124bp的一段ND2序列进行分析。BLAST搜索结果显示 l-31号爪哇金丝燕和淡腰金丝燕所产的燕窝样品的最相似序列均为爪哇金丝燕A fuciphagus，其中23个爪哇金丝燕燕窝样品的最高相似度为100％，另8个淡腰金丝 燕燕窝样品的最高相似度为98％；32号大金丝燕所产的毛燕窝样品的最相似序列为大 II 金丝燕A．maximus。NJ系统发育树结果显示，1—31号所有样品均与爪哇金丝燕A．．屈c咖hagus聚为一支，支持率为62％；其中11、17、2l、22、23、25、26、28号样品 金丝燕A．maximus。NJ系统发育树结果显示，1—31号所有样品均与爪哇金丝燕A． ．屈c咖hagus聚为一支，支持率为62％；其中11、17、2l、22、23、25、26、28号样品 与其他样品又另分为一支，支持率为82％；32号样品与所有的大金丝燕A．maximus 聚为一支，支持率为72％。将所有燕窝样品和Genbank下载的相关物种124bp的该段 ND2序列进行比对，结果显示淡腰金丝燕彳．屈c功hagus germani与爪哇金丝燕A． 屈c咖hagus存在2个简约信息位点，大金丝燕A．maximus的序列与爪哇金丝燕相比具 有10个简约信息位点，而金丝燕属不同物种之间各自具有多个变异位点。 3． 最终选取29个燕窝样品长度为1 79bp的一段COI序列进行分析，BLAST搜索 及NJ系统发育树结果显示，关于燕窝样品的生物基原和Cytb及ND2序列的鉴定结 果完全一致，所有淡腰金丝燕所产的燕窝样品单独聚为一支，支持率为79％。COI序 列比对结果显示淡腰金丝燕A．fuciphagus germani与爪哇金丝燕A．fuciphagus存在2 个简约信息位点，大金丝燕A．maximus的序列与爪哇金丝燕相比具有9个简约信息位 点。 4． 最终选取22个燕窝样品长度为560bp的一段12S rRNA序列进行分析，