基于DNA条形码及UFLC技术的藏药翼首草遗传-化学相关性研究-药物分析学专业论文.docxVIP

成都中医药大学 成都中医药大学 2015 届硕士毕业论文 万方数据 万方数据 中文摘要 翼首草（藏文名“榜孜毒乌”），是一种常用藏药，收载于《中 国药典》(2010 年版一部)[1]及卫生部《藏药标准》等标准中[2]，包括“鉴别”、 “检查”、“含量测定”，其薄层鉴别及含量测定所用标准品为熊果酸和齐墩果 酸，缺乏专属性。翼首草质量控制指标性成分缺乏理论依据。同时，其薄层鉴别 易导致结果的不准确性。藏医院临床用药经验、文献查阅表明翼首草治疗类风湿 性关节炎疗效显著[3-10]，以及现代药理学研究表明翼首草确有抗炎、止痛等功效 [11-16]，但是目前对其抗类风湿性关节炎药效物质基础研究较匮乏，使其临床用药 有效性不能得到广泛认可，限制了其进一步应用。 翼首草为多年生草本植物，2000 年被列为一级濒危藏药物种[17]。藏医古籍 文献、藏医院及现代药材标准对翼首草药用部位的规定不统一，其全草、地上部 分、地下部分均有入药。现行药典规定其药用部位为全草[1]，如果继续全草入药， 将会对其资源造成严重破坏。目前其研究主要集中在对不同产地[18]、不同用药部 位[19]翼首草中总皂苷的含量比较研究，未能整体性体现翼首草不同药用部位所含 化学成分情况，其用药部位的确定没有理论依据。 综上所述，有必要建立 DNA 条形码技术鉴别藏药翼首草药材。对翼首草吸 收入血成分进行初步研究，确定其质量控制指标性成分,以及为其后期活性成分 追踪研究奠定基础。运用 UFLC 分析技术研究藏药翼首草不同药用部位化学成分 差异，并通过其遗传信息与化学相关性研究为其品质评价及资源保护提供新模 式。 目的： 1.鉴别藏药翼首草药材真伪。 2.初步研究翼首草血中移行成分，为确定其质量控制指标性成分提供依据。 3.建立藏药翼首草不同药用部位的指纹图谱，并比较二者差异。结合翼首草 入血成分为其药用部位确定提供理论依据。研究翼首草遗传信息与化学成分之间 的相关性。 课题来源：国家自然科学基金项目；四川省教育厅四川省省属高校科研创新团队建设计划 (11TD004)。 I 方法： 1.采用试剂盒法提取翼首草样品 DNA，PCR 扩增其 ITS2 序列并双向测序， 所得序列经过 CodonCode Aligner 拼接后，用软件 MEGA5.1 进行数据分析。 2.采用 HPLC 法，对翼首草入血成分进行初步研究。 3.采用 UFLC 法对翼首草地上地下部位指纹图谱研究,并运用 SPSS、灰色关 联度等分析软件进行数据分析。 结果： 1.DNA条形码鉴别：实验所得序列与各自查询序列的相似度达99%，说明实 验药材样本来源准确。翼首草药材种内变异分析结果表明，57个样本的ITS2序列 长度为232bp，共获得6个单倍型。翼首草的ITS2种内K2P遗传距离为0~0.04003， 种内平均K2P距离为0.0038。基于ITS2序列构建翼首草NJ系统聚类树，结果表明， 翼首草的57个个体聚在一起Bootstrap支持率均在86%以上。 2.翼首草吸收入血成分分析：比较翼首草供试品、空白血清及含药血清HPLC 色谱图发现，含药血清中共有9个移行成分，其中5个为原形成分，分别为绿原酸 、 獐牙菜苷、林生续断苷I 、吴茱萸苷 、续断苷B，另外4个为代谢成分，结构未 知。 .翼首草不同部位指纹图谱分析：分别建立了 17 批次翼首草药材地上、地 下部位的指纹图谱，地上部分共提取了 15 个色谱峰（地下部分有 13 个共有峰）， 其中 6、7 号峰为地下部分缺失峰，结构未知。对其中的 7 个色谱峰通过对照品 指认已被确认，分别为绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、林生续断苷 I、吴茱萸苷、 续断苷 B、大花双参苷 A。7 个已知峰在地上、地下部分中均存在。 .翼首草遗传--化学相关性研究：翼首草 DNA 种内距离与其大多数成分之 间的相关性较低，而与其中的 4、8、10、13 号峰之间的关联性较高，均0.8， 通过对照品指认 4、8、10、13 号峰分别为马钱苷、林生续断苷 I、吴茱萸苷、大 花双参苷 A，均为环烯醚萜苷类化合物。 结论： 1. ITS2序列可以作为能稳定、准确鉴别翼首草药材的DNA条形码序列，为 翼首草鉴定提供新的技术手段。 2. 初步揭示了翼首草的入血成分，为后期其质量控制指标性成分确定提供 II 依据。 3. 翼首草地上部分所含化学成分较地下部分全面。理论上可以以地上部分 替代全草部分入药。 4. 揭示了翼首草遗传基因可能对其所含环烯醚萜苷类次生代谢产物的产生 有较大的影响。 关键词：藏药；翼首草；DNA 条形码鉴定；UFLC 指纹图谱；遗传-化学；相关性 III Abstract Pterocephalus hookeri (BangZiDuWu in Ti