dna重组质粒的构建概述.ppt

　 　 　 外源基因与载体的连接 粘性末端连接 * 由于操作简便，质粒最为常用。 * 严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝， 不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。 TA克隆：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。TA克隆没有方向性。? * 消耗能量 长转录导致不正确的二级结构，降低翻译效率。 * 丝状噬菌体F1 * * * * 总的来说连接反应时的温度不宜过高，否则片段末端容易松脱不易连接（分子热运动随温度升高而加剧），但又不能太低否则连接酶活性太低。 * * 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 同裂酶 限制性内切酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。 星号活性的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。因此, 尽量采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。 星号活力 克隆（有时与甲基化酶联用） 鉴定（基因片断大小、正反向） 检测突变（识别位点，限制酶切图谱的多态性RFLP） 制作Marker 限制性内切酶的应用 限制性内切酶的使用 一个标准的酶切反应包含： DNA 合适的酶缓冲液 蛋白酶 为了提高酶切效率，可加入BSA。 1、建立一个标准的酶切反应 通常，10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1ug lambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。 应用中的注意点 2. 选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。内切酶的产物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接 3、加酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。 4、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素 5、缓冲液 对于每一种酶都提供相应的最佳缓冲液，可保证酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响 6、 反应体积 内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中） 7、混合 这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！ 8、反应温度 大部分酶的反应温度为37℃；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65℃不等 9、反应时间 1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全 10、终止反应 如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。我们使用如下反应终止液：50