基于Notch信号通路通腑解毒法干预铜负荷大鼠的认知障碍及海马细胞凋亡的实验分析-中医临床基础专业论文.docxVIP

基于 基于 Notch 信号通路通腑解毒法干预铜负荷大鼠的认知障碍及海马细胞凋亡的实验研究 湖北中医药大学 湖北中医药大学 2015 届博士学位论文 PAGE PAGE VII PAGE PAGE VI 状况改善，饮食、饮水量明显增加。治疗 6 周后，各个治疗组大鼠均明 显增加体重。在整个实验期间，正常对照组大鼠没有死亡。模型对照组 大鼠死亡 3 只，各给药组在给药过程，不明原因死亡 2 只。 3.2 Morris 水迷宫认知功能实验：定位航行实验中模型对照组大鼠平均 逃避潜伏期较正常对照组明显延长(P0.01)，青霉胺、肝豆灵低、中、 高剂量组均较模型组平均逃避潜伏期显著减少(P0.01)。各药物治疗组 之间：肝豆灵低剂量组与中剂量组之间比较无显著差异(P＞0.05)，但是 与高剂量组和青霉胺组比较均有显著差异(P0.05)，说明肝豆灵低中高 剂量组在此试验中有相当的差异，随剂量的升高，疗效有明显提高，呈 现剂量依赖性特点；而肝豆灵高剂量组与青霉胺组之间的平均逃避潜伏 期比较无显著差异，（P＞0.05)，说明此两组对大鼠的学习记忆中的定位 航行疗效相当。空间探索实验中与模型组比较，正常对照组、肝豆灵高 剂量组和青霉胺组均明显增加大鼠的跨越原平台位置次数(P0.01)，而 肝豆灵的低中剂量组则无明显增加，无统计学差异(P＞0.05)；与正常组 对照，肝豆灵高剂量组和青霉胺组的跨越原平台位置次数均无明显差异 (P＞0.05)，而模型组和肝豆灵低中剂量组则有极显著差异(P0.01)。与 模型对照组大鼠比较，正常对照组、肝豆灵高剂量组和青霉胺组均极显 著的缩短游泳总距离 (P0.01)，肝豆灵的低中剂量组也有较为明显缩短 (P0.05)。从 Morris 水迷宫实验研究发现，肝豆灵和青霉胺可显著改善 WD 模型大鼠的学习记忆等认知功能，而且肝豆灵的疗效呈现剂量依赖性 特点。 3.3 通腑解毒方肝豆灵对铜负荷大鼠海马组织病理及 TUNEL 细胞凋亡的影 响 3.3.1 光镜下的海马病理形态学观察 病理切片 HE 染色，光学显微镜下观察发现，正常对照组大鼠的海马组 织神经细胞分布正常，排列整齐，以锥形细胞为主，主树突明显，细胞核 大，呈圆形或椭圆形，染色深，核仁清晰。模型组海马区组织结构疏松， 细胞数量减少、排列紊乱，部分细胞胞浆疏松化和空泡变性；部分区域细 胞细胞缺失；少数细胞体积缩小，胞浆浓缩，核结构模糊，细胞周围出现 透明环状带，呈现明显凋亡特征性改变。各治疗组与模型组相比较神经元 细胞变性坏死减轻,凋亡细胞减少，细胞数较多，结构基本正常。 3.3.2 肝豆灵、青霉胺不同治疗组对铜负荷大鼠诱导的海马神经元凋 亡的影响 采用 TUNEL 染色检测各组的海马神经元凋亡。正常对照组的海马神经 细胞罕见凋亡，模型对照组海马可见大量的棕褐色颗粒即凋亡细胞，AI 与其余各组均有极显著差异（P0.01）；肝豆灵低中高治疗组与青霉胺组 也可见凋亡细胞，但较模型组明显减少，AI 差异有统计学意义（P0.01）； 肝豆灵低剂量组与青霉胺组的 AI 差异显著（P0.01），而高中剂量组则 与青霉胺组的 AI 相差不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。 3.4. 通腑解毒中药肝豆灵对铜负荷大鼠海马组织 Notch 信号通路蛋白表 达及神经细胞凋亡的影响 3.4.1 免疫组化法检测 Notch-1、Hes-1 蛋白表达： Notch-1、Hes-1 蛋白阳性信号呈棕黄色，模型组及各治疗组可见阳性 表达，模型组的平均光密度值较空白组明显减少(P0.05)，各治疗组较模 型组 Notch-1、Hes-1 明显增加(P0.05)，青霉胺组则有极显著差异 (P0.01 )。 3.4.2 实时荧光定量 PCR 检测 Notch-1、Hes-1mRNA 基因的相对表达： 模型对照组的海马组织的 Notch-1 、Hes-l 的基因相对表达量显著减 少（P0.01）, 各个中西医治疗组上调了 Notch-1、Hes-1mRNA 基因的相 对表达，其中肝豆灵高剂量组和青霉胺组与模型对照组比较，均显著增 加表达量（P0.01）。 3.4.3 实时荧光定量 PCR 检测铜负荷大鼠模型对照组的海马组织的 Caspase-3 基因相对表达量显著增加（P0.01）, 各个中西医治疗组的 Caspase-3 的基因相对表达量则有所下调，其中肝豆灵低中高剂量组、青 霉胺组与模型对照组比较，均显著下调其表达量（P0.01）。 4.结论 4.1 本研究采用铜负荷方法复制了 WD 模型，模型组表现为神经认知障碍， 该模型反映了铜沉积可以导致神经系统损伤，从而引起神经认知功能障 碍。 4.2 本研究发现铜过量负荷大鼠模型可见认知功能的下降，通腑解毒中 药肝豆灵对铜负荷大鼠有