生物化学第14章核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法.ppt

RNA的热变性曲线 RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变性温度范围较宽。不管是DNA还是RNA，加入甲酰胺可降低其Tm值。双链RNA的变性曲线几乎与双链DNA相同。 1.一种浮萍的18SrRNA 2.酵母的杀伤RNA（双链）加甲酰胺 3.同2，但无甲酰胺 DNA的复性 变性DNA在适当条件下，可以使两条分开的单链重新缔合成双链DNA，这个过程称为复性（renaturation）。将热变性的单链DNA骤然冷却，DNA不能复性，只有缓慢降温才能使热变性的DNA复性，这个过程又称为退火（annealing）。 不同DNA的复性曲线 核酸杂交 核酸杂交是以已知的异源DNA或RNA片段为探针，检测与之互补的DNA或RNA的存在。多数情况下是对探针进行标记，少数情况下标记的是被检测的DNA或RNA。 第15章 核酸的研究方法 (Research methods of nucleic acid) 一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应（PCR） 六、DNA的化学合成 一、核酸的分离、提纯和定量测定 DNA的分离Ⅰ 真核生物细胞中的染色体DNA与碱性的组蛋白结合在一起，成为核蛋白（DNP），DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/L NaCl），但不溶于生理盐水（0.14mol/L NaCl）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L，使DNP纤维沉淀出来。用玻璃棒将DNP纤维缠绕在棒上，再经多次溶解和沉淀以纯化DNP。 DNA的分离Ⅱ 用水饱和的苯酚抽提，DNA溶于上层水相，变性蛋白质沉淀于两相的界面上或停留在酚相中。如此反复操作以除净蛋白质。将含DNA的水相合并，在有盐的条件下加2倍体积的冷乙醇，将DNA沉淀出来，用乙醚或乙醇洗涤沉淀。用此方法可得到纯的DNA。 用RNase处理除去残留的RNA 。为了得到大分子的DNA，应防止核酸酶和机械力对DNA的破坏。 RNA的分离 分离RNA时要特别注意防止RNase对RNA的降解。RNase无处不在，且耐高温，不易灭活。 制备RNA通常需要注意3点： ①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温烘烤，塑料用具须经高压灭菌，不能高压灭菌的器具要用0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC，RNase的不可逆抑制剂）浸泡处理，再煮沸以除净DEPC。 ②在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂（如盐酸胍）。 ③在提取和纯化RNA的试剂中加入RNase的抑制剂（如RNasin）。 RNA的分离方法 目前最常用的制备RNA的方法有两个： 1．用酸性胍盐提取，然后用苯酚和氯仿多次抽提除去蛋白质。异硫氰酸胍是极强烈的蛋白质变性剂。此法用于小量制备RNA。 2．用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度1.33g/cm3，在最上层；DNA密度在1.71g/cm3左右，位于中间；RNA密度1.89g/cm3，沉在底部。 分离poly(A)+ RNA通常采用寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸亲和层析法。 核酸含量的测定 紫外分光光度法 定磷法 定糖法 二、核酸的超速离心 核酸密度的测定Ⅰ 将8.0mol/L的CsCl装入离心管中，DNA样品溶于CsCl溶液，加在离心管顶部。以45000转/分的速度离心16小时以上，此时离心管中形成线性的CsCl密度梯度，底部为1.80g/cm3，顶部为1.55g/cm3。DNA样品带停留在与之密度相应的位置。根据此位置的CsCl密度，可知DNA的密度。 核酸密度的测定Ⅱ 也可用一已知密度的DNA与待测密度的DNA一起离心，根据两条带的位置及已知DNA的密度，计算出待测DNA的密度。 式中ρ和ρ0分别为待测DNA和标准DNA的密度，r和r0分别为待测DNA和标准DNA区带位置与离心轴心的距离，ω为角速度（弧度/秒）。 测定DNA中G－C含量 含G－C多的DNA密度大，DNA中G－C的百分含量与其浮力密度呈正比，所以测出了DNA的浮力密度就可以计算出其G－C百分含量。 DNA中G-C含量与密度的关系 Salmon sperm 鲑鱼精子 Pneumococcus 肺炎链球菌 Serratia 沙雷氏菌 M. Phlei 草分支杆菌 溶液中核酸构象的研究 RNA只有局部双螺旋，它的浮力密度比双链DNA高，双链DNA又比蛋白质的密度高，双链DNA变性后成为单链，密度增加。利用密度梯度离心可以研究核酸分子的构象变化及其动力学过程。 纯化核酸 离心时加入溴化