半乳糖氧化酶的生物电化学特性-上海师范大学学报.PDF

维普资讯 第31卷 第4期 上海师范大学学报 (自然科学版) V0I．31，NO．4 2002年 12月 JournalofShanghaiTeachersUniversity(NaturalSciences) 2002 ．Dec． 半乳糖氧化酶的生物 电化学特性 贾能勤，朱 燕，江丽萍，吴霞琴，章宗穰 (上海师范大学 生命与环境学院，上海 200234) 摘 要 ：采用循环伏安法对半乳糖氧化酶 (GAO)进行 了生物电化学特性的研 究．实验结 果表 明，由于半乳糖氧化酶 的酶活性 中心深埋在酶 内部 ，所以该酶在铂 电极上的直接 电 化学行为较难观察到 ，而二茂铁甲醇作为介体能明显地改善酶活性 中心的电子传递 ，加快 电子传递速率．且测定 了半乳糖氧化酶与二茂铁 甲醇之 间的反应速度常数 Ks为1．2× 10I ·mol一 ·S_。． 关键词 ：半乳糖氧化酶 ；二茂铁 甲醇 ；循环伏安法 中图分类号 ：0646 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—5137(2002)04—0038—04 0 引 言 测定半乳糖含量在发酵工业、食品工业和医疗诊断等方面具有重要意义．尤其血液 中半乳糖的 测定 ，对于新生儿半乳糖血症 的早期诊断具有重要作用_1]．半乳糖氧化酶 (EC1．3．3．9，分子量为 68KD)是 由一条含639个氨基酸基团的单聚肽链组成 、以铜原子为活性 中心的酶，目前大多采用半 乳糖氧化酶催化氧化半乳糖来测定样 品中半乳糖 的含量 ，但所用方法较复杂且成本较高．所以有必 要对半乳糖氧化酶的特性进行研究，以期开发出测试简便、快速 的半乳糖生物传感器． 有报道 已采用 电子顺磁共振 (EPR)，X一射线吸收光谱 (XAS)，圆二色谱 (CD)等 州方法对半 乳糖氧化酶生化特性 (如氧化还原机理)进行 了研究，但对其生物电化学特性表征还少有报道．本文 利用电化学方法考察 了半乳糖氧化酶的直接 电化学特性及加人介体后对其活性 中心的电子传递 的 促进作用． 1 实验部分 1．1 仪器和试剂 PARC273型 Potentiostat／Galvanostat电化学测量 系统 (EGG公司)．1ram 的微铂盘工作电极 (中科 院上海冶金所)，5×6ram。铂片为对 电极 ，饱和甘汞 电极 (SCE)为参 比电极 (上海 电光器 材厂)． 收稿 日期 ：2001—10—2O 基金项 目：上海市教委发展基金 (CL9709)和上海师范大学科研基金资助项 目(DQO8) 作者简介：贾能勤 (1970一)，男 ，上海师范大学生命与环境科学学院讲师 维普资讯 第4期 贾能勤，朱 燕，江丽萍，等：半乳糖氧化酶的生物 电化学特性 半 乳 秸 氧化 酶 (．~tgma公 一J，l6，000U ／g)，二戊 饫 甲酹 (分 T)T纯 ，Aldrmh hem o)．具他 试 介IJ明 为分析纯．所用支持 电解质为磷酸缓冲溶液 ，用二次蒸馏水配制． 1．2 实验方法 将微铂盘工作 电极实验前先用丙酮及二次水清洗，再在Au．O。L～LLU—Ln／~U…KTI~，。溶液 中以1∞mV／s的 速度在一0．2～+1．4V范围内循环扫描 ，使电极活化 ，直至循环扫描 曲线重合． 称取适量的半乳糖氧化酶溶于5ml磷酸缓冲液中配制成lmg／mI的酶溶液．在恒温25C下 ， 采用 电极体系。在一0．2～+0．5V(vsSCE)范 围内讲行循环伏寄扫描 。涮 其循环伏安行为． 2 结 果 与 讨 论 2．1 半乳糖氧化酶的直接 电化学行为 图1是用微铂盘 电极在 img／mi半乳糖氧化酶的磷酸溶液 中测得 的循环伏安 图．从 图la上可 看出，电极未进行 阴极化处理 ，则观察不到氧化还原峰．而电极阴极化后再进行循环伏安扫描 ，可以 看到随着扫描速度的增加 ，氧化峰、还原峰出现且峰电流增大 ，如图1b所示．这是 由于阴极极化活 化 了电极及反应物．但氧化还原峰电位差大于15OmV，仍属于不可逆电化学反应．由此可见 ，由于