半夏块茎高质量总RnA提取的一种有效方法-中国中药杂志.PDF

第３３卷第１５期 　　　 中国 中药杂 志 Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ　１５ ２００８年８月 　　　　　　　　　ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ　　　　　　　 Ａｕｇｕｓｔ，２００８ 半夏块茎高质量总ＲＮＡ提取的一种有效方法 １，２ ２ １，３ 黄月琴 ，徐有明 ，薛建平 （１．淮北煤炭师范学院生命科学学院，安徽 淮北２３５０００； ２．华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉４３００７０； ３．资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北２３５０００） ［摘要］　目的：探讨一种有效提取半夏块茎总ＲＮＡ方法。方法：以半夏试管苗的叶片、叶柄和块茎为试验材 料，将常规的异硫氰酸胍提取植物总ＲＮＡ的方法做了改进，在ＲＮＡ提取缓冲液中加入高浓度的 巯基乙醇以除 β 去酚类物质，用酸酚／氯仿抽提去除蛋白质污染，以及利用异丙醇和醋酸钠联合沉淀多糖等手段，建立了一种简单 实用的从富含多酚类和多糖等物质的植物材料中提取总ＲＮＡ的方法。结果：该方法所提ＲＮＡ的Ａ ／Ａ 均大于 ２６０ ２３０ ２０，Ａ ／Ａ 的值为１７～２０，电泳条带清晰，ＲＮＡ完整性好。结论：利用本方法提取的半夏试管小块茎总ＲＮＡ具 ２６０ ２８０ 有很高的质量和纯度，且得率很高，完全满足后续的ＤＤＲＴＰＣＲ和反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ等分子生物学研究，而且简 单经济、实验结果稳定，重复性好，适合富含多酚类和多糖等物质的药用植物组织总ＲＮＡ的提取。 ［关键词］　半夏；试管块茎；多酚类物质；多糖；总ＲＮＡ；提取 ［中图分类号］Ｒ２８２．５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００８）１５１８１００４ 　　植物组织ＲＮＡ的提取是进行植物分子生物学 改进了常规的异硫氰酸胍法，通过在ＲＮＡ提取缓冲 方面研究的必要前提。要进行 ＲＴＰＣＲ，ｃＤＮＡ合 液中加入高浓度的 巯基乙醇，以及利用异丙醇和 β 成、ＲＮＡ序列分析、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、狭线杂交、引 醋酸钠联合沉淀多糖等手段，从半夏试管小块茎中 物延伸，以及用ｍＲＮＡ差异显示技术筛选感兴趣的 提取出了高质量、高纯度的总ＲＮＡ，并在ＲＴＰＣＲ反 相关基因等分子生物学研究，均需要有高质量、高纯 应中检验了其完整性好，能够满足ｍＲＮＡ差异显示 度、完整性好的ＲＮＡ。可以说，分子生物学研究后 实验，为今后利用分子生物学手段研究半夏资源提 续工作的进展及成效在很大程度上取决于ＲＮＡ的 供技术参考。 质量。所以，如何提高ＲＮＡ纯度和经济而快捷地获 １　材料 得足够量的ＲＮＡ是当前研究人员十分关注的问题。 半夏材料由资源植物生物学安徽省重点实验室 植物组织ＲＮＡ的提取最常用的方法是异硫氰酸胍 提供，经薛建平教授鉴定为天南星科三叶半夏 ［１］ ＰｉｎｅｌｌｉａｔｅｒｎａｔａＢｒｅｉｔ．的试管苗和试管微型块茎。 法，但半夏块茎富含多糖及酚类物质 ，由于酚类 化合物的存在，ＲＮＡ提取过程中极易产生褐化效 ２　方法 ［２］ ２．１　常规提取方法［６］ 应 ，氧化的酚类化合物（如醌类）可以与ＲＮＡ不 可逆地结合，导致 ＲＮＡ的降解及 ＲＮＡ活性的丧 异硫氰酸胍法：取２ｇ半夏组织，置于