使用Wizard大量制备试剂组由大肠杆菌大量制备质体.DOCVIP

警告：本课程所介绍的实验具潜在地危险并需完整地安全训练、特别的设备及仪器，并需有适当的人员于一旁监督。你必须为实施这些安全措施及方法承担唯一的责任、义务及危险性。麻省理工学院无须为所提供的教材或实施所提供的数据担负任何责任、义务及危险性。 使用Wizard大量制备试剂组由大肠杆菌大量制备质体 第一天 于200ml含有适当抗生素的培养基种入含有你感兴趣的质体之大肠杆菌菌种； 于37°C培养一夜 备齐TE (10mMTris.HCL， pH 8.1； 1mM EDTA， pH 8)， 80% 乙醇； 确认有isopropanol与粗棉布(cheesecloth)； 并确认大量制备试剂组的清洗缓冲液*(Wash Buffer)已加了乙醇 第二天 于GSA旋转子以每分6000转离心5分； 去除上清液 将沉淀的细胞充分悬浮于15毫升悬浮缓冲液*(Resuspension Buffer) 当以漩涡方式悬浮细胞时， 加入15毫升的溶解缓冲液 *(Lysis Buffer) 一旦细胞溶解 (一般需1-20分， 悬浮液会较澄清且较黏)， 以漩涡方式式悬浮溶液并加入15毫升的中和缓冲液*(Neutalization Buffer) 立刻于GSA旋转子以每分6500转离心10分； 在离心时， 准备一些装有约27毫升isopropanol的离心瓶(每个样本一个)， 并于瓶口置放一块粗棉布(或其它过滤材质) 将上清液倒入装有isopropanol的离心瓶 (刚开始你可于粗棉布上弄个袋状凹痕， 将上清液倒入凹痕中) 混合均匀后， 于GSA旋转子以每分8000转离心15分 去除上清液后， 将多余液体以纸巾吸干； 加入2毫升TE于离心瓶以溶解沉淀物(你可能看不到沉淀物， 但不要让它妨碍你) 加入10毫升混合均匀的Maxiprep Resin*， 以漩涡方式充分混合 (小心！它含有强腐蚀性的亚氨基甲二胺) 将Maxiprep Column*固定于抽气管(每个样本一个)， 将resin/DNA混合液倒入Maxiprep Column； 启动抽气机 当样本流过Maxiprep Column， 吸取13毫升清洗缓冲液*(加了乙醇)于离心瓶， 漩涡方式旋转瓶身将残留的resin/DNA冲洗出来， 并于前一次resin/DNA混合液通过后倒入Maxiprep Column 吸取12毫升清洗缓冲液*再次冲洗离心瓶并如前一步骤倒入Maxiprep Column 加12毫升80% 乙醇于Maxiprep Column做最后的清洗； 让抽气机继续抽2-5分以让Maxiprep Column干燥 将Maxiprep Column撤离抽气管， 将之置于50ml 蓝盖的管子中于临床用离心机(有吊篮的)以每分约4500转离心5分； 同时预温一些 TE至55-65°C 由管子取出Maxiprep Column， 吸出任何残留于管底的液体；再将Maxiprep Column置于管中并于Column中加入 1.5-2ml 预温的TE 约1分后， 再次于临床用离心机以每分4500转离心5分 DNA溶液将聚集于离心管底； 将溶液分装于微量离心管或有旋转盖的管子， 储存于4°C *Wizard Maxiprep 试剂组供给