蒙古黄芪AFLP分子标记反应体系的建立与优化-江苏农业科学.PDF

— ４０— 江苏农业科学　２０１８年第４６卷第１９期 姜志艳，杨慧楠，邵学勤．蒙古黄芪ＡＦＬＰ分子标记反应体系的建立与优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１９）：４０－４３． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１９．０１０ 蒙古黄芪ＡＦＬＰ分子标记反应体系的建立与优化 姜志艳，杨慧楠，邵学勤 （内蒙古科技大学生命科学与技术学院，内蒙古包头０１４０１０） 　　摘要：以内蒙古特色药用植物黄芪为试验材料，建立并优化 １套适用于黄芪的扩增片段长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，简称ＡＦＬＰ）反应体系。对ＡＦＬＰ反应体系的影响因素基因组ＤＮＡ的提取、内切酶的确定 及酶切时间、预扩增、选择性扩增反应等关键因素进行优化，并对 ＡＦＬＰ适宜引物进行筛选。结果表明，黄芪基因组 ＤＮＡ的模板以５０ｎｇ／Ｌ为宜，采用ＥｃｏＲ ／Ｍｓｅ 进行双酶切，酶切连接采用一步法完成；最佳酶连时间为１６ｈ；预扩 μ Ⅰ Ⅰ 增反应产物稀释２０倍作为选扩模板，筛选出适用于黄芪ＡＦＬＰ分析的引物组合５对：Ｅ－ＡＧ／Ｍ－ＣＧＴ、Ｅ－ＡＴ／Ｍ－ ＣＴＧ、Ｅ－ＧＡ／Ｍ－ＣＡＡ、Ｅ－ＴＣ／Ｍ－ＣＡＡ、Ｅ－ＧＴ／Ｍ－ＣＴＧ，为黄芪的分子标记辅助育种、遗传图谱构建、种质资源研究 奠定了基础。 　　关键词：扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）；内蒙古；黄芪；分子标记；反应体系；优化 ＋ 　　中图分类号：Ｓ５６７．２３９．０１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１９－００４０－０３ 　　蒙古黄芪［Ａｓｔｒａｇａｌｉｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．ｖａｒ． １　材料与方法 Ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ（Ｂｇｅ．）Ｈｓｉａｏ］为豆科黄芪属，是内蒙古特色药 用植物，具有很好的药用价值和经济价值。由于目前黄芪野 １．１　植物材料 ［１］ 生资源稀缺，大多进行人工栽培 。近些年来，对药用植物 供试材料为蒙古黄芪，黄芪幼叶于２０１７年７月采集于包 黄芪的研究主要集中在其药理活性成分分析、有效成分提取 头医学院内蒙古特色药用植物繁育种植基地。－８０℃保存 ［２］ 等 ，而有关黄芪的利用分子标记辅助育种、数量性状基因 备用，黄芪组培苗于室内培养。 座（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ，简称ＱＴＬ）定位、构建分子遗传连锁 １．２　试验方法 图谱和进行黄芪种质遗传多样性研究的相关信息较少。 １．２．１　基因组 ＤＮＡ提取及检测　对黄芪单株叶片进行 扩增 片 段 长 度 多 态 性 （ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ ＤＮＡ的提取，黄芪基因组ＤＮＡ提取采用植物基因组ＤＮＡ提 ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，简称 ＡＦＬＰ）具有多态性高、ＤＮＡ用量少、无需 取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，用 １％琼脂糖凝 预知基因组序列信息、稳定性好等优点，该分子标记技术被广 胶电泳检测所提取ＤＮＡ的纯度和完整性，用紫外可见分光光 ［３］ 泛应用于植物遗传育种、种质资源研究 、遗传多样性分 度计测定ＤＮＡ的浓度和纯度，保存于－２０℃冰箱。 ［４－６］ ［７］ 析 、构建遗传图谱（尤其是高密度分子图谱） 及基因定 １．２．２　基因组 ＤＮＡ的酶切 －连接　使用限制性内切酶 ［８］ 位 等方面。目前，已有研究者利用简单重复序列标记 ＥｃｏＲ 与Ｍｓｅ （购自ＮＥＢ）对黄芪基因组ＤＮＡ进行双酶切，