纸层析法鉴定转氨基作用-赣南医学院.PDF

Gannan Medical University 纸层析法鉴定转氨基作用 赣南医学院 生物化学与分子生物学教研室 [目的] 1.掌握氨基酸转氨基作用和纸层析的原理 2.熟悉纸层析的操作方法。 [原理] 在转氨酶的作用下，某一氨基酸去掉 α-氨基 生成相应的α-酮酸，而另一种 α-酮酸得到此氨基 生成相应的氨基酸的过程，称为氨基酸的转氨基作 用。 Ø层析理论 层析法 （色谱法）：是利用混合物各组分物理、 化学性质 （如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等） 的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同的区域， 借以将各组分分离。 固定相——滤纸结合的水 流动相——乙醇 由于混合物中的有效成分和杂质受固定相的阻力 和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度不同， 有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、 吸附和交换作用，最终结果是使混合物得到分离。 [步骤] 1.制备肝匀浆 2.转氨基反应 取干净试管2支，分别标明测定管与 对照管，按下表操作。 管号 测定管 对照管 试剂 （滴） 肝匀浆 10d 10d 37℃水浴10min 沸水浴10min 丙氨酸 10d 10d α-酮戊二酸 10d 10d 37℃水浴30min 3.准备：取直径15cm圆形滤纸1张，用圆规在滤纸正 中作一半径为1cm的小圆圈，用铅笔通过圆心作两点 互相垂直的线，并在两线外端等距离点4个原点，标 明测、对、谷、丙。在滤纸圆心处打一小孔 （如铅笔 芯粗细），另取同类滤纸小片1.5cm ×3cm，下三分之 二剪成须状。将其卷成圆筒如灯芯状，插入小孔 （略 突出于滤纸面） [步骤] 4.点样 分别用采血管吸取测定管上清液、对照管 上清液、谷氨酸溶液、丙氨酸溶液各1滴，依次点在 滤纸上标明测、对、谷、丙的点样处。注意点样斑点 不可太大。直径应小于0.5cm 。必要时可再点一次， 每点一滴，用吹风机吹干后方可再点第二滴，并且点 样量应力求均匀相等。 5.层析 将滤纸放在培养皿上，灯芯下端浸入层析液 中进行层析。约30分钟后，去除灯芯，立即用铅笔划 出溶剂前沿，用吹风机吹干。 6.显色 将滤纸平放在培养皿上，用喷瓶 向滤纸均匀喷洒 0.1%茚三酮溶液，再用吹风机吹干，可见紫红色的同 心弧形斑点。 7.计算 按下表记录有关数据，计算Rf值。 “谷” “丙” “对”“测1、2” 点样处至色斑中心距离(A) 点样处至溶剂前沿距离(B) Rf值(A/B) 将 “对”、 “测”各色斑的Rf值与已知氨基酸的Rf 值进行对比，确定它们各是什么氨基酸。据此解释转 氨基作用。