基于超高速离心浓缩技术的HBV低载量样本检测体系的初步研究-免疫学专业论文.docxVIP

中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文中文摘要 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文 中文摘要 背景和目的：乙肝病毒是我国主要的输血传播病原体之一。虽然目前在全国统一开 展了核酸检测措施，但仍然存在一定的残余风险。主要因为部分献血者体内病毒载 量极低，低于常用的多人份混样检测试剂的灵敏度，加之目前大部分进口试剂的设 计不太适合国内的病毒流行株。针对目前出现的问题，本文主要目的是初步研究适 合中国流行特征的HBV低载量样本的筛查／定量检测体系。 方法：1、选定磁珠法提取体系的成分，通过正交设计表初步确定其浓度或酸碱 度，主要包括GuSCN、蛋白酶K、异丙醇及PH；固定其它因素，优化单一成分浓度， 最终确定提取体系各成分浓度；选择4种厂家的硅基磁珠，比较不同磁珠的提取效 果；确定磁珠种类后，优化磁珠用量。确定提取体系后与成品化提取试剂盒(包括 QIAamp@DNA Blood Mini Kit及MagPure Viral DNA／RNA Mini KF Kit)进行比较。 2、在NCBI的Nucleotide中输入HBV、China、complete genome等关键词找到 中国地区的HBV序列，经比对后在保守序列设计引物探针，引物扩增的PCR产物经 PMD—19载体连接制备成质粒标准品并测序验证序列，计算质粒拷贝数，并稀释成不 同浓度的质粒标准品，购买第三方标准品对质粒标准品进行校正，绘制HBV标准曲 线，并用Probit分析计算检测下限，验证灵敏度、特异性等。将建立好的HBV荧 光定量检测方法检测100例样本，并与罗氏cobas固TaqScreen MPX Test，version 2．0 检测试剂盒检测结果进行相关性分析。 3、用ItBV阴性血浆稀释ltBV标准品，制成低拷贝样本；固定离心时间，研究不同 离心力与病毒回收率的关系：固定离心力，研究离心时间对回收率的影响：最后使 用低载量样本对超高速浓缩技术进行验证并评估其应用价值。 结果： 1、提取体系的优化结果：GuSCN浓度2．OM，蛋白酶K浓度为0．89mg／ml，异丙 醇35％，PH为8；磁珠的选择：A磁珠；磁珠用量：30ul。建立的磁珠提取系统在 高、中、低三个浓度的提取效率与两种试剂盒比较均有统计学差异。 2、建立的HBV检测体系引物探针特异性好，质粒测序结果完全吻合，标准品 曲线R20．999，扩增效率为92．75％，线性范围为5．OxlO-2．5x109IU／mL，95％检测 下限为16．2IU／mL，批内重复变异系数为0．15％-1．11％，批间变异系数为 0．91％一4．67％。与罗氏检测结果相关关系为y=O．916x+2．186，(R=O．96；PO．001)。 4 万方数据 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文3、当离心力在150009一908009时，HBV病毒回收率从41．43％增加至88．29％； 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文 3、当离心力在150009一908009时，HBV病毒回收率从41．43％增加至88．29％； 当离心力在为908009一1389009时，HBV病毒回收率相对稳定在80％一90％之间；当离 心力在1389009-1710009时，HBV病毒回收率从88．29％下降至62．94％。离心时间为 0．5h、lh、1．5h及2h时，其回收分别为88．31％、89．70％、88．40％、75．62％。运用 浓缩技术后，发现8例cobas@TaqScreen MPK Test，version 2．0漏检样本。 4、将超高速离心浓缩技术与本实验建立的HBV检测体系结合时，单个样本取 样量不少于2ml时(N人份混检时，每个样本取2ml混合，共N*2m1)，离心浓缩 后灵敏度可达2IU／mL；单个样本取样量不少于4ml时(N人份混检时，每个样本取 4ml混合，共N*4m1)，灵敏度可达1IU／mL。 结论； l、通过优化提取试剂成分及浓度，成功建立起实验室血浆HBV病毒核酸的磁珠提 取体系。 2、建立了适合中国HBV病毒流行特征的HBV荧光定量检测体系。 3、建立了基于超高速离心浓缩的HBV检测方法，提高病毒检出率。 关键词：HBV；磁珠法核酸提取；荧光定量PCR：超高速离心：病毒浓缩 5 万方数据 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文 ABSTRACT Background and objective：Hepatitis B virus is one of the major infectious diseases of transfusion—transmitted pathogens．Although nucleic acid