基于超抗原SEB的小鼠肺癌免疫基因治疗-外科学专业论文.docxVIP

酉直医叠太堂亟±堂焦论銮基因的引物，正向引物序列为：5’．AAGTA陀刚硎GATGCCACCATG— 酉直医叠太堂亟±堂焦论銮 基因的引物，正向引物序列为：5’．AAGTA陀刚硎GATGCCACCATG— TACAACAGACTCTTCGTCAGCC一3’；反向引物：：5’．GCCGAGG彳刃CC，- TCACTTCTTCTl’AGTTGTCAGGTATA．3。引物的5’端分别设计有XbaI (TCTAGA)、BamHI(GGATCC)酶切位点。2．通过核酸分子克隆技术将SEB 基因克隆到质粒PCDH—CMV—GFP中，构建成SEB表达质粒PCDH-SEB-GFP； 并用测序方法和酶切方法进行鉴定。3。用脂质体将构建的PCDH-SEB-GFP 重组质粒转染体外培养的小鼠Lewis肺癌细胞，并用Westem Blot检测转 染细胞中SEB蛋白的表达情况。4．将小鼠Lewi s肺癌细胞接种到C57小鼠 右侧腋下(3×106个细胞／只)，当肿瘤体积约为50ram3时，将小鼠分为实 验组、阴性对照组和空白对照组，每组6只小鼠。实验组小鼠瘤内注射 PCDH-SEB-GFP质粒，阴性对照组瘤内注射空载质粒PCDH-CMV-GFP，空白 对照组注射等体积的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)。质 粒注射每3天一次，共3次，每次质粒用量为20ug，脂质体20ul，用无血 清培养基调整至lOOul。每2天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算 瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线，最后一次质粒注射后2天，剥出眼球采血， 并处死小鼠，完整剥离肿瘤块，测量肿瘤长径和短径，据此计算瘤体体积， 比较各组小鼠瘤体体积；用电子天平称量肿瘤质量，比较各组小鼠平均瘤 重的差异。5．取各组小鼠肿瘤组织作常规HE染色，观察肿瘤组织有无坏 死，以及有无炎细胞浸润；用免疫组化方法检测肿瘤组织中SEB表达情况； 酶联免疫吸附试验(enzyme．1inked immunosorbent assay，ELISA)方法检测 各组小鼠血清中细胞因子Y一干扰素(Interferon-?，IFN-?)、肿瘤坏死因子-0【 (tumor necrosis factor．Q，TNF．0【)的浓度。 一2一 万方数据 酉直医抖太堂亟±堂僮j金塞结果： 酉直医抖太堂亟±堂僮j金塞 结果： 1、本研究合成的SEB基因长度为801bp，通过琼脂糖凝胶电 泳、基因测序鉴定，基因大小及序列与预期结果完全一致。2、成功构建 SEB基因表达质粒，测序和酶切鉴定结果与预期结果一致。3、用脂质体 方法将PCDH—SEB—GFP和PCDH—CMV—GFP质粒分别转染小鼠Lewi s肺癌细 胞，24小时后，部分细胞内可见绿色荧光，转染效率约40％：Western blot 实验结果显示，转染PCDH—SEB—GFP质粒的Lewis肺癌细胞中有SEB蛋白 表达，而转染空载体PCDH—CMV—GFP质粒的Lewis肺癌细胞及空白组(未 转染)无SEB蛋白表达。4、成功构建Lewi s肺癌细胞C57小鼠肿瘤模型， 小鼠成瘤率100％，成瘤期间小鼠无死亡。实验组(瘤内注射PCDH-SEB-GFP 质粒)小鼠平均瘤体体积、瘤体质量小于对照组，空白组小鼠瘤体总体积、 质量明显大于其余2组。5、HE染色显示实验组所有小鼠肿瘤剖面见出血、 坏死区，阴性对照组少数肿瘤可见灶性小坏死区，空白组肿瘤无明显坏死 区域；实验组和阴性对照组有炎性细胞浸润，其中实验组更明显，空白对 照组无明显炎细胞浸润；免疫组化实验显示，实验组部分肿瘤细胞表达 SEB，其余两组肿瘤内无表达SEB细胞；ELISA结果提示各组细胞因子水 平无明显差异。 结论：1、通过质粒脂质体转染方法，超抗原SEB原核细菌基因能在Lewis 肺癌细胞中表达。2、超抗原SEB基因能抑制小鼠肿瘤生长。 关键词：肺癌；免疫基因治疗；葡萄球菌肠毒素B；质粒 一3一 万方数据 酉直医科太堂亟±堂焦论窒Immuno—gene 酉直医科太堂亟±堂焦论窒 Immuno—gene Therapy of Superantigen SEB gene for Mice Lewis Lung cancer Abstract：Background and Objective：Lung cancer has become the No．1 cancer killer throughout the world．In China，the incidence and mortality of lung cancer is still keeping rising．Although effect of treatment for lung cancer was improve