甲状旁腺激素羧基端肽段细胞凋亡作用的研究-生物医学工程专业论文.docxVIP

天津医科大学硕士学位论文中文摘要 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 ．甲状旁腺素(PTH)是由甲状旁腺主细胞合成分泌的、调节钙磷代谢及骨转 换的重要肽类激素。人体血液循环中存在三种PTH分子：PTHl．84、PTH37-84及 少量PTH7．跗，后两者称为PTH羧基端肽段(C．PTH)。研究发现，PTHl-34具有 ∥ 与PTHl．84完全相同的受体结合能力及促成骨作用，美国FDA已于2001年批准 ∥} 甲状旁腺素(134)肽(rhPTHl．34)用于治疗妇女绝经后骨质疏松症。但实验发现， 当给予大鼠PTHl-34后骨肉瘤的发病率明显上升(最高致瘤率达52％)。近来发 现，人体内存在C．PTH受体(CPTHR)，C．PTH与其特异性受体(非PTH受体) 结合后可产生促细胞凋亡的生物学效应。因此我们推断PTHl-34的成骨．即抗成骨 细胞凋亡作用可能诱发成瘤，而C．PTH的促凋亡作用可抑制PTHl．34的成瘤效应。 该推断如果成立，将会对PTH在调节骨代谢方面作用的研究产生极其深远的影 响。 目的 本研究拟从细胞实验和动物实验两方面，采用real．time PCR、western blot 等实验技术和方法探讨PTHI．84、PTH37埘及PTHl斟对细胞周期的作用。已期阐 明不同PTH分子对成骨细胞凋亡的不同作用，特别是人体内所含有的C．PTH分 子即PTH37-84对成骨细胞细胞周期及细胞凋亡的影响，从而进一步证明C．PTH 有促凋亡的作用，可能与抑制肿瘤的发生有关。 方法 1．培养原代成骨细胞：2日龄大鼠，采用酶交替消化法对成骨细胞进行分离。 ALP染色、Von Kossa染色进行鉴定。 2．进行药物干预：加入10。9 mol／L的PTHl．34，PTH37．甜，PTHl．阴，对照组加 、 、r 入等体积的PBS，培养24h后，收获细胞，分别提取总RNA和蛋白质。 J 3．采用real-time PCR技术，2AACT法在删阱A水平检测骨肉瘤相关凋亡基因： bax、bel．2、caspase3、c-los、cyclin D1，并检测管家基因GAPDH作为内参 照。SPSSl4．0统计软件处理试验数据，多组比较采用单因素方差分析，两两 比较采用Student-Newman-Keuls检验。 4．采用western blot技术，在蛋白质水平检测骨肉瘤相关凋亡蛋白(检测对象同 上)，并检测管家基因GAPDH作为内参照。将曝光后X．ray照片用UVP凝 胶成像分析系统进行扫描，计算各基因蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的 天津医科大学硕士学位论文光密度比值，推算各凋亡因子表达的变化趋势。 天津医科大学硕士学位论文 光密度比值，推算各凋亡因子表达的变化趋势。 5．构建动物模型：对于联合切除甲状腺及甲状旁腺的大鼠随机分成4组，分别 给予4099／Kg的PTHl出、PTH37斟，PTHI．84及生理盐水，给药持续2个月，取 骨组织分别提取总RNA和蛋白质。 6．采用real-time PCR、western blot技术检测骨肉瘤相关凋亡基因在mRNA水 平及蛋白质水平的表达。(同细胞实验部分) 结果 1．细胞实验部分： (1)原代成骨细胞的鉴定：原代成骨细胞经传代后，于显微镜下观察，细胞贴壁 生长，形态以不规则形、长梭形、三角形为主，经ALP染色，说明细胞纯度 较高。并采用Von Kossa染色，镜下见黑色的矿化结节，说明本实验分离得 原代成骨细胞具有矿化功能。 (2)PTHl斟对原代成骨细胞的作用：实验结果显示，给予10母mol／L的PTHl-34的 原代成骨细胞，抑制细胞凋亡的基因(如bel一2，easpase3，c-fos，cyclin D1)与对 照组相比，表达量明显增加；促进细胞凋亡的基因(如bax)与对照组相比，表 达量明显降低。mRNA水平与蛋白质水平结果一致。 (3)PTH37斟对原代成骨细胞的作用：实验结果显示，给予10母mol／L的PTH37斟 的原代成骨细胞，促进细胞凋亡的基因(如bax)与对照组相比，表达量明显增 加；抑制细胞凋亡的基因(如bcl．2，easpase3，e-fos，eyelin D1)与对照组相比， 表达量明显降低。mRNA水平与蛋白质水平结果一致。 2．动物实验部分： (1)成功建立动物模型。 ’ (2)PTHI．34对大鼠成骨细胞的作用：给予4099／Kg PTHl-34的大鼠检测结果与细胞 c， 实验一致，且mRNA水平与蛋白质水平结果一致。 』 (3)P1H37埘对大鼠成骨细胞的作用：给予401xg／Kg PTH37．84的大鼠检测结果与细 胞实验一致，且mRNA水平与蛋白质水平结果一致。 结论 1．我们成功培养了大鼠原代成骨细胞。细胞实验证实10母m